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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２３２７—２００９进出口动物源性食品中角黄素、虾青素的检测方法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犮犪狀狋犺犪狓犪狀狋犺犻狀犪狀犱犪狊狋犪狓犪狀狋犺犻狀犻狀犳狅狅犱狊狅犳犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀犳狅狅犱犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋２００９０７０７发布２０１００１１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布食品伙伴网书书书前 言 本标准附录Ａ、附录Ｂ和附录Ｃ均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局。本标准主要起草人：余孔捷、钱疆、刘正才、杨方、黄杰、李耀平、李捷。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２３２７—２００９食品伙伴网进出口动物源性食品中角黄素、虾青素的检测方法１ 范围本标准规定了进出口动物源性食品中角黄素、虾青素的高效液相色谱检测与液相色谱质谱／质谱确证法。本标准适用于黄鱼、鳗鱼、鸡肉、鸡蛋、鸭肝、猪肾和牛奶中角黄素、虾青素的测定与确证。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 方法提要试样用乙腈提取，正己烷脱脂、浓缩后，高效液相色谱仪进行检测，外标法定量。如有必要可用液相色谱质谱／质谱法确证。４ 试剂和材料所有试剂除特殊注明外，均为分析纯，水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。４．１ 乙腈：色谱纯。４．２ 正己烷：色谱纯。４．３ 正丙醇。４．４ 甲酸。４．５ ２，６二叔丁基对甲酚（ＢＨＴ）：化学纯。４．６ 无水硫酸钠：６５０℃灼烧４ｈ，贮于干燥器内，冷却后备用。４．７ 乙酸铵。４．８ 乙腈提取剂：０．２５ｇＢＨＴ溶解于５００ｍＬ乙腈。４．９ ＢＨＴ乙腈溶液：５ｇＢＨＴ溶解于５００ｍＬ乙腈。４．１０ 乙酸铵溶液（５ｍｍｏｌ／Ｌ，含０．２％甲酸）：称取０．３８ｇ乙酸铵，用水溶解稀释后，加２．０ｍＬ甲酸，加水至１．０Ｌ。４．１１ 角黄素标准品：ｃａｎｔｈａｘａｎｔｈｉｎ，ＣＡＳ：５１４７８３，纯度大于等于９０％，于４℃避光贮存。４．１２ 虾青素标准品：ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ，ＣＡＳ：４７２６１７，纯度大于等于９０％，于－１８℃避光贮存。４．１３ 标准储备液：分别准确称取适量（相当于５．００ｍｇ纯品，精确至０．０１ｍｇ）角黄素、虾青素标准品，分别加入ＢＨＴ乙腈溶液（４．９）溶解，定容于２００ｍＬ棕色容量瓶，配制成浓度为２５．０μｇ／ｍＬ的标准储备液。充氮气置－１８℃避光保存，可使用两周。４．１４ 混合标准工作液：分别准确移取摇匀的角黄素、虾青素标准储备液，混合，用乙腈准确稀释成适宜浓度，即配即用。１犛犖／犜２３２７—２００９食品伙伴网５ 仪器和设备５．１ 高效液相色谱仪：配二极管阵列（ＤＡＤ）或紫外可见（ＵＶＶｉｓ）检测器。５．２ 液相色谱串联质谱仪：配有电喷雾（ＥＳＩ）离子源。５．３ 分析天平：感量０．０１ｍｇ，０．０１ｇ。５．４ 旋涡混合器。５．５ 超声提取器。５．６ 离心机：５０００ｒ／ｍｉｎ。５．７ 旋转蒸发器。５．８ 微孔滤膜：０．２２μｍ，有机系。６ 试样制备和保存６．１ 黄鱼、鳗鱼、鸡肉、鸭肝、猪肾从所取全部样品中取出有代表性样品可食部分约５００ｇ，用高速组织捣碎机充分捣碎、混匀。６．２ 鸡蛋从所取全部样品中取出有代表性样品可食部分约５００ｇ（生蛋应煮熟冷却后剥壳），用高速组织捣碎机充分捣碎、混匀。６．３ 牛奶从所取全部样品中取出有代表性样品约５００ｇ，充分混匀，置于合适洁净容器。制样操作过程中应防止样品受到污染或发生角黄素、虾青素含量的变化，制样温度不应高于３０℃，制样后应立即测定。需存放的试样应密封于洁净容器、避光、于－１８℃以下冷冻存放。７ 测定步骤７．１ 提取与净化称取试样约５ｇ（精确至０．０１ｇ）于５０ｍＬ离心管中，加入３０ｍＬ乙腈提取剂（４．８）及１０ｇ无水硫酸钠（４．６）后，涡旋混合１ｍｉｎ，在３５℃以下水浴超声提取１０ｍｉｎ，再以３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ。将上清液移入预置有２０ｍＬ正己烷的１２５ｍＬ分液漏斗中，振摇０．５ｍｉｎ后，静置分层；收集下层乙腈相，正己烷相留在分液漏斗，待本试样后续脱脂重复使用。按上述步骤对离心管中的残留物每次用２０ｍＬ乙腈提取剂再重复提取两次，所得提取液用上述正己烷相依次脱脂。合并三次脱脂后所收集的乙腈相，加入５ｍＬ正丙醇，于４０℃以下旋转蒸发浓缩至近干，用乙腈溶解并定容至５．０ｍＬ，０．２０μｍ滤膜过滤，滤液待测。测定操作应避强光、连续进行。７．２ 高效液相色谱法测定７．２．１ 色谱条件ａ） 色谱柱：ＷａｔｅｒｓＳｙｍｍｅｔｒｙＣ１８，４．６ｍｍ（内径）×２５０ｍｍ，５μｍ，或相当者；ｂ） 柱温：３５℃；ｃ） 流动相：乙腈水（９５＋５，体积比）；ｄ） 流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；ｅ） 检测波长：４７１ｎｍ；ｆ） 进样量：５０μＬ。７．２．２ 色谱测定根据试样中被测物的含量情况，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析。标准工作液和待测样液中角黄素、虾青素的响应值应在仪器线性响应范围内。标准工作液与待测样液等体积进样。在上２犛犖／犜２３２７—２００９食品伙伴网述色谱条件下，虾青素反式、顺式异构体保留时间分别约为８．４ｍｉｎ、１０．６ｍｉｎ，角黄素反式、顺式异构体的保留时间分别约为１７．５ｍｉｎ、１９．０ｍｉｎ，根据峰面积外标法定量。标准品色谱图参见附录Ａ图Ａ．１。７．３ 确证７．３．１ 液相色谱质谱／质谱条件ａ） 色谱柱：ＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣＢＥＨＣ１８柱，２．１（内径）ｍｍ×５５ｍｍ，１．７μｍ，或相当者；ｂ） 柱温：３０℃；ｃ） 进样量：１０μＬ；ｄ） 流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ；ｅ） 流动相和梯度洗脱：流动相和梯度洗脱程序见表１；ｆ） 离子源：电喷雾源ＥＳＩ，正离子模式；ｇ） 扫描方式：多反应监测（ＭＲＭ）。其他参考质谱条件参见附录Ｂ中表Ｂ．１。表１ 流动相和梯度洗脱程序时间／ｍｉｎ乙腈／％乙酸铵溶液（４．１０）／％曲线０９０１０直线３．４９８２直线３．８９０１０直线５９０１０直线７．３．２ 液相色谱质谱／质谱确证将７．１中所得样液（必要时用液相色谱纯乙腈稀释至适当浓度）和混合标准工作液用ＬＣＭＳ／ＭＳ检测。如果样液和混合标准工作液两者检出的色谱峰保留时间一致，并且在扣除背景后的样品谱图中，各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下得到的标准溶液谱图相比，其相对偏差不超过表２中规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。角黄素、虾青素标准品多反应监测（ＭＲＭ）离子色谱图参见附录Ｃ的图Ｃ．１。表２ 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度／％＞５０＞２０～５０＞１０～２０≤１０允许的相对偏差／％±２０±２５±３０±５０７．４ 空白实验除不称取试样外，按上述测定步骤进行。８ 结果计算采用外标法定量，按式（１）计算样品中角黄素或虾青素的含量：犡＝犃×犮×犞犃ｓ×犿…………………………（１） 式中：犡———样品中角黄素或虾青素的含量（顺、反式异构体总量），单位为毫克每千克（ｍｇ／ｋｇ）；犃———测定液中角黄素或虾青素的峰面积；犮———标准工作液中角黄素或虾青素的浓度，单位为微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；犞———定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；犃ｓ———标准工作液中角黄素或虾青素的峰面积；犿———最终样液所代表的样品质量，单位为克（ｇ）。３犛犖／犜２３２７—２００９食品伙伴网９ 测定低限与回收率９．１ 测定低限本方法中高效液相色谱法对角黄素、虾青素的测定低限均为：０．１ｍｇ／ｋｇ。９．２ 回收率高效液相色谱法测定角黄素、虾青素的回收率数据参见表３。表３ 回收率数据基体添加浓度／（ｍｇ／ｋｇ）角黄素回收率／％虾青素回收率／％黄鱼０．１８１．８～１０７．５８２．０～１０７．９０．２８８．６～１０５．０８３．０～１０５．００．４８９．７～１０４．１９２．５～９７．５１８０．６～１０４．２８５．４～１０６．８鳗鱼０．１８２．２～９３．８８０．１～９０．９０．２８３．２～９３．８８１．１～８９．８０．４８０．６～９０．７８０．８～９９．８１８７．１～９９．８８３．１～９９．３鸡肉０．１８０．２～１０８．１８０．９～９７．８０．２８６．４～１０７．３８１．１～１０４．００．４９４．０～１０８．７８０．１～９２．９１９５．９～１０８．０８０．３～８９．８鸡蛋０．１８８．７～９９．９８６．８～１０４．９０．２８１．５～９７．０８２．０～９４．４０．４８４．７～９３．６８４．３～９３．６１８１．３～８９．９８０．８～９２．０鸭肝０．１８７．５～１０９．０９０．３～１０１．００．２９１．３～１０９．８８８．７～１０１．００．４９０．３～１０４．０９５．１～１０１．７１９５．７～１０５．６９３．０～１０２．０猪肾０．１８４．９～１００．５８０．４～９３．５０．２７９．７～９２．７８１．３～９２．１０．４８１．６～９２．２８０．２～８５．３１８０．１～９７．６８８．６～９５．０牛奶０．１８３．３～１０９．０８０．４～８６．４０．２８３．９～１００．４８０．７～８８．１０．４８９．８～１０８．０７９．９～９７．１１８９．６～１０２．３８２．８～９０．６４犛犖／犜２３２７—２００９食品伙伴网附 录 犃（资料性附录）标准品高效液相色谱图１———虾青素反式体；２———虾青素顺式体；３———角黄素反式体；４———角黄素顺式体。图犃．１ 标准品的高效液相色谱图５犛犖／犜２３２７—２００９食品伙伴网附 录 犅（资料性附录）参考质谱条件１）参考质谱条件：ａ） 电离方式（Ｐｏｌａｒｉｔｙ）：ＥＳＩ＋；ｂ） 电离电压（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ）：３．０ｋＶ；ｃ） 离子源温度（ＳｏｕｒｃｅＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）：１１５℃；ｄ） 脱溶剂气温度（ＤｅｓｏｌｖａｔｉｏｎＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）：３４０℃；ｅ） 锥孔反吹气流量（ＣｏｎｅＧａｓＦｌｏｗ）：４５Ｌ／ｈ（氮气）；ｆ） 脱溶剂气流量（ＤｅｓｏｌｖａｔｉｏｎＧａｓＦｌｏｗ）：７５０Ｌ／ｈ（氮气）；ｇ） 碰撞室压力（ＧａｓＣｅｌｌＰｉｒａｎｉＰｒｅｓｓｕｒｅ）：４．０６×１０－３ｍｂａｒ（碰撞气为氩气）；ｈ） 其他质谱参数见表Ｂ．１。表犅．１ 主要参考质谱参数化合物母离子（ｍ／ｚ）子离子（ｍ／ｚ）锥孔电压／Ｖ碰撞能量／ｅＶ驻留时间／ｓ角黄素５６４．８０１３３．４０２０３．３０２０．０２０．０２８．０２０．００．１００．１０虾青素５９７．３６１４６．９０３７８．７０２６．０２６．０１９．０１２．００．１００．１０１） 所列参考质谱条件是在ＱｕａｔｔｒｏＰｒｅｍｉｅｒＸＥ型液质联用仪上完成的，对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。６犛犖／犜２３２７—２００９食品伙伴网附 录 犆（资料性附录）标准品多反应监测（犕犚犕）离子色谱图ａ）虾青素ｂ）虾青素ｃ）角黄素ｄ）角黄素 １———虾青素反式体； ２———虾青素顺式体； ３———角黄素反式体； ４———角黄素顺式体。图犆．１ 角黄素、虾青素标准品多反应监测（犕犚犕）离子色谱图７犛犖／犜２３２７—２００９食品伙伴网犉狅狉犲狑狅狉犱犃狀狀犲狓犃，犪狀狀犲狓犅犪狀犱犪狀狀犲狓犆狅犳狋犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犪狉犲犻狀犳