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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２２３９—２００８进出口动物源性食品中氮氨菲啶残留量检测方法液相色谱质谱／质谱法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犻狊狅犿犲狋犪犿犻犱犻狌犿狉犲狊犻犱狌犲犻狀犳狅狅犱狊狋狌犳犳狊狅犳犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犔犆犕犛／犕犛犿犲狋犺狅犱２００８１１１８发布２００９０６０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布食品伙伴网书书书前 言 本标准的附录Ａ和附录Ｂ均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局和中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局负责起草。本标准主要起草人：王国民、陈冬东、李贤良、周启明、李应国、张雷、唐柏彬、王建华、康庆贺。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２２３９—２００８食品伙伴网进出口动物源性食品中氮氨菲啶残留量检测方法液相色谱质谱／质谱法１ 范围本标准规定了动物源性食品中氮氨菲啶残留量的制样和液相色谱质谱／质谱检测方法。本标准适用于牛肉、牛肝、牛肾、牛脂肪、羊肝、鸡肝、鱼肉及牛奶中氮氨菲啶残留量的测定和确证。２ 方法提要试样中的氮氨菲啶用乙腈和甲酸铵甲醇混合溶液提取，提取液经浓缩、脱脂后，用液相色谱质谱／质谱仪测定，外标峰面积法定量。３ 试剂和材料所有试剂除特殊注明外，均为分析纯，水为二次蒸馏水。３．１ 甲醇：高效液相色谱级。３．２ 甲酸：高效液相色谱级。３．３ 乙腈：高效液相色谱级。３．４ 正己烷。３．５ 无水硫酸钠：６５０℃灼烧４ｈ，在干燥器内冷却至室温，贮于密封瓶中备用。３．６ 甲酸铵：优级纯或相当者。３．７ 甲酸铵甲醇溶液（０．２５ｍｏｌ／Ｌ）：称取１５．８ｇ甲酸铵溶于１０００ｍＬ甲醇（３．１）中。３．８ ８０％甲醇溶液：取甲醇（３．１）８００ｍＬ，加水稀释至１０００ｍＬ，混匀。３．９ 提取液：取乙腈（３．３）和甲酸铵甲醇溶液（３．７）进行１∶１混合（体积比）。３．１０ 氮氨菲啶盐酸盐（ＩｓｏｍｅｔａｍｉｄｉｕｍＣｈｌｏｒｉｄｅ，ＣＡＳ号：３４３０１５５８，分子式：Ｃ２８Ｈ２６ＣｌＮ７）标准品：纯度大于或等于９７．０％。３．１１ 氮氨菲啶标准储备液：准确称取适量氮氨菲啶盐酸盐标准品，用甲醇配制成氮氨菲啶浓度为１００μｇ／ｍＬ的标准储备液。此溶液在０℃～４℃避光保存，可使用３个月。３．１２ 标准工作溶液：根据需要用空白样品提取液将标准储备液稀释成５．０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、２０．０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、５００ｎｇ／ｍＬ的标准工作溶液。置于０℃～４℃避光保存，可使用３天。３．１３ ０．２２μｍ微孔滤膜，有机系。４ 仪器和设备４．１ 高效液相色谱质谱／质谱仪，配电喷雾离子源（ＥＳＩ）。４．２ 天平：感量为０．０１ｇ和０．０００１ｇ。４．３ 超声波清洗器。４．４ 旋涡混匀器。４．５ 氮吹仪。４．６ 离心机：５０００ｒ／ｍｉｎ。４．７ 均质器：１００００ｒ／ｍｉｎ。１犛犖／犜２２３９—２００８食品伙伴网４．８ 容量瓶：１００ｍＬ、５０ｍＬ、１０ｍＬ。４．９ 具塞塑料离心管：５０ｍＬ。５ 试样的制备与保存肌肉、内脏和鱼：取有代表性样约５００ｇ，用组织捣碎机捣碎，装入洁净容器作为试样，密封并做好标识，于－１８℃冰箱内保存。奶：取有代表性样品约５００ｇ，搅拌均匀后装入洁净容器内密封并做好标识，于４℃冰箱内保存。制样操作过程中应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。６ 测定步骤６．１ 提取与净化６．１．１ 肌肉、内脏（肝脏、肾脏）、脂肪及鱼肉准确称取５ｇ试样（精确到０．０１ｇ）于５０ｍＬ具塞离心管中，加入２ｇ无水硫酸钠混匀，再加入２０ｍＬ提取液（３．９），用均质器均质２ｍｉｎ，４０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，将有机相转移至５０ｍＬ容量瓶中，残渣再用２×１０ｍＬ提取液（３．９）均质提取。离心合并有机相，用提取液（３．９）定容至５０ｍＬ，混匀后取２．００ｍＬ用氮吹仪在３５℃下浓缩至干。定量加入２．００ｍＬ８０％甲醇溶液（３．８）溶解残渣，加入２ｍＬ正己烷（３．４）旋涡混匀２ｍｉｎ后，２５００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，将下层过０．２２μｍ滤膜后，供液相色谱质谱／质谱仪测定。６．１．２ 奶准确称取５ｇ试样（精确到０．０１ｇ）于５０ｍＬ具塞离心管中，加入２０ｍＬ提取液（３．９），盖上盖混匀，超声提取１５ｍｉｎ，冷却后将有机相过滤转移至５０ｍＬ容量瓶中，残渣再用２×１０ｍＬ提取液（３．９）超声提取，离心合并有机相。接下来按照６．１．１中“离心合并有机相”后的步骤进行。６．２ 测定６．２．１ 液相色谱质谱／质谱条件ａ） 液相色谱串联质谱仪；ｂ） 色谱柱：ＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣＴＭＢＥＨＣ１８柱，２．１ｍｍ（内径）×１００ｍｍ，１．７μｍ，或相当者；ｃ） 流动相：甲醇０．２％甲酸，梯度洗脱程序见表１；表１ 流动相梯度洗脱程序时间／ｍｉｎ甲醇／％０．２％甲酸／％０１０．０９０．０３．００９０．０１０．０４．００９０．０１０．０４．５０１０．０９０．０５．００１０．０９０．０ ｄ） 流速：０．２０ｍＬ／ｍｉｎ；ｅ） 柱温：３５℃；ｆ） 进样量：１０μＬ；ｇ） 离子源：电喷雾离子源；ｈ） 扫描方式：正离子；ｉ） 检测方式：多反应监测（ＭＲＭ）；ｊ） 质谱／质谱参考条件参见附录Ａ。２犛犖／犜２２３９—２００８食品伙伴网６．２．２ 定性、定量测定按照６．２．１液相色谱质谱／质谱条件测定样液和标准工作溶液，外标标准曲线法测定样液中的氮氨菲啶残留量。样品中待测物残留量应在标准曲线范围之内，如果残留量超出标准曲线范围，应用空白样品提取液进行适当稀释。在上述色谱条件下，氮氨菲啶的质量色谱峰保留时间约为３．０ｍｉｎ。标准品的多反应监测色谱图参见附录Ｂ中的图Ｂ．１。在相同实验条件下，样品与标准工作液中待测物质的质量色谱峰相对保留时间在２．５％以内，并且在扣除背景后的样品质量色谱图中，所选择的离子对均出现，同时与标准品的相对丰度允许偏差不超过表２规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。表２ 使用液相色谱质谱／质谱定性时相对离子丰度最大容许误差相对丰度（基峰）／％液相色谱质谱／质谱定性时相对离子丰度最大允许误差／％＞５０±２０大于２０至小于等于５０±２５大于１０至小于等于２０±３０小于等于１０±５０６．２．３ 空白试验空白样品，按上述测定步骤进行。７ 结果计算和表述用数据处理软件中的外标法，或绘制标准曲线，按照式（１）计算样品中氮氨菲啶残留量。犡＝（犮－犮０）×犞犿×１０００……………………………（１） 式中：犡———试样中氮氨菲啶的残留量，单位为毫克每千克（ｍｇ／ｋｇ）；犮———由标准曲线得到的样液中氮氨菲啶的浓度，单位为纳克每毫升（ｎｇ／ｍＬ）；犮０———由标准曲线而得的空白实验中的氮氨菲啶的浓度，单位为纳克每毫升（ｎｇ／ｍＬ）；犞———样液最终定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；犿———最终样液所代表的试样质量，单位为克（ｇ）。８ 测定低限、回收率８．１ 测定低限本方法氮氨菲啶的测定低限为０．００５ｍｇ／ｋｇ。８．２ 回收率８．２．１ 牛肌肉中氮氨菲啶添加浓度及其回收率数据：———添加浓度在０．００５ｍｇ／ｋｇ时，回收率在７０．０％～８４．０％之间；———添加浓度在０．０１０ｍｇ／ｋｇ时，回收率在７１．０％～８６．０％之间；———添加浓度在０．０２０ｍｇ／ｋｇ时，回收率在７２．５％～８５．０％之间。８．２．２ 牛肝脏中氮氨菲啶添加浓度及其回收率数据：———添加浓度在０．００５ｍｇ／ｋｇ时，回收率在７８．０％～１０４．０％之间；———添加浓度在０．０１０ｍｇ／ｋｇ时，回收率在７４．０％～１０３．０％之间；———添加浓度在０．０２０ｍｇ／ｋｇ时，回收率在７４．５％～１０３．０％之间。８．２．３ 牛肾脏中氮氨菲啶添加浓度及其回收率数据：———添加浓度在０．００５ｍｇ／ｋｇ时，回收率在６８．０％～８０．０％之间；３犛犖／犜２２３９—２００８食品伙伴网———添加浓度在０．０１０ｍｇ／ｋｇ时，回收率在６７．０％～８２．０％之间；———添加浓度在０．０２０ｍｇ／ｋｇ时，回收率在７１．０％～９２．０％之间。８．２．４ 牛脂肪中氮氨菲啶添加浓度及其回收率数据：———添加浓度在０．００５ｍｇ／ｋｇ时，回收率在８６．０％～１０４．０％之间；———添加浓度在０．０１０ｍｇ／ｋｇ时，回收率在８１．０％～９３．０％之间；———添加浓度在０．０２０ｍｇ／ｋｇ时，回收率在８５．５％～１０１．５％之间。８．２．５ 牛奶中氮氨菲啶添加浓度及其回收率数据：———添加浓度在０．００５ｍｇ／ｋｇ时，回收率在７６．０％～９４．０％之间；———添加浓度在０．０１０ｍｇ／ｋｇ时，回收率在７５．０％～９４．０％之间；———添加浓度在０．０２０ｍｇ／ｋｇ时，回收率在８３．５％～１０１．５％之间。８．２．６ 羊肝中氮氨菲啶添加浓度及其回收率数据：———添加浓度在０．００５ｍｇ／ｋｇ时，回收率在８２．０％～１０２．０％之间；———添加浓度在０．０１０ｍｇ／ｋｇ时，回收率在８４．０％～１０１．０％之间；———添加浓度在０．０２０ｍｇ／ｋｇ时，回收率在８４．５％～１００．５％之间。８．２．７ 鸡肝中氮氨菲啶添加浓度及其回收率数据：———添加浓度在０．００５ｍｇ／ｋｇ时，回收率在８４．０％～１０２．０％之间；———添加浓度在０．０１０ｍｇ／ｋｇ时，回收率在８３．０％～１０１．０％之间；———添加浓度在０．０２０ｍｇ／ｋｇ时，回收率在８３．５％～１００．５％之间。８．２．８ 鱼肉中氮氨菲啶添加浓度及其回收率数据：———添加浓度在０．００５ｍｇ／ｋｇ时，回收率在７８．０％～１０２．０％之间；———添加浓度在０．０１０ｍｇ／ｋｇ时，回收率在６８．０％～８１．０％之间；———添加浓度在０．０２０ｍｇ／ｋｇ时，回收率在７０．５％～７９．０％之间。４犛犖／犜２２３９—２００８食品伙伴网附 录 犃（资料性附录）参考质谱条件１）参考质谱条件：ａ） 毛细管电压：１．２ｋＶｂ） 离子源温度：１１０℃ｃ） 脱溶剂气温度：３５０℃ｄ） 锥孔气流量（氮气）：４５Ｌ／ｈｅ） 脱溶剂气流量（氮气）：６００Ｌ／ｈｆ） 碰撞气压力（氩气）：０．２２ｍＬ／ｍｉｎｇ） 碰撞室压力（氩气）：３．０３ｅ－３（ｍｂａｒ）ｈ） 定性离子对、定量离子对、锥孔电压、碰撞能量、驻留时间见表Ａ．１。表犃．１ 待测物定性离子对、定量离子对、锥孔电压、碰撞能量、驻留时间化合物母离子（ｍ／ｚ）子离子（ｍ／ｚ）锥孔电压／Ｖ碰撞能量／ｅｖ驻留时间／ｓ氮氨菲啶４６０２９８ａ３１．０２５０．３０３１３３１．０２５０．３０ ａ离子为定量离子。 注：对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。１） 非商业性声明：附录Ａ所列参考质谱条件是在ＷａｔｅｒｓＵＰＬＣ／Ｐｒｉｅｍｅｒ型液质联用仪上完成的，此处列出试验用仪器型号仅为提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家或型号的仪器。５犛犖／犜２２３９—２００８食品伙伴网附 录 犅（资料性附录）氮氨菲啶的多反应监测（犕犚犕）离子色谱图图犅．１ 氮氨菲啶标准溶液（５μ犵／犔）多反应监测离子色谱图６犛犖／犜２２３９—２００８食品伙伴网犉狅狉犲狑狅狉犱犃狀狀犲狓犃犪狀犱犅狅犳狋犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犪狉犲犻狀犳狅狉犿犪狋犻狏犲犪狀狀犲狓犲狊．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊狆狉狅狆狅狊犲犱犫狔犪狀犱狑犪狊狌狀犱犲狉狋犺犲犮犺犪狉犵犲狅犳犖