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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２２２６—２００８进出口动物源性食品中乌洛托品残留量的检测方法 液相色谱质谱／质谱法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狌狉狅狋狉狅狆犻狀犲狉犲狊犻犱狌犲犻狀犳狅狅犱狊狋狌犳犳狊狅犳犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犔犆犕犛／犕犛犿犲狋犺狅犱２００８１１１８发布２００９０６０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布食品伙伴网书书书前 言 本标准的附录Ａ和附录Ｂ均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘永、杨长志、王国民、康庆贺、林维宣、李贤良、吴岩、程阳、王冰、郭伟。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２２２６—２００８食品伙伴网进出口动物源性食品中乌洛托品残留量的检测方法 液相色谱质谱／质谱法１ 范围本标准规定了进出口动物源性食品中乌洛托品残留量的液相色谱质谱／质谱检测方法。本标准适用于进出口鸡肉、鸡肝脏、鸡肾脏和猪肉中乌洛托品残留量的检测和确证。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方面研究使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和实验方法（ＧＢ／Ｔ６６８２—２００８，ＩＳＯ３６９６：１９８７，ＭＯＤ）３ 方法提要用乙腈提取试样中的乌洛托品残留，正己烷除去脂溶性杂质，阳离子交换固相萃取柱净化，洗脱液浓缩后残渣用碱性乙腈定溶，液相色谱质谱／质谱仪测定，外标法定量。４ 试剂和材料所有试剂除特殊注明外，所用试剂均为分析纯，水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。４．１ 乙腈：色谱纯。４．２ 正己烷：色谱纯。４．３ 甲醇：色谱纯。４．４ 乙酸（９９％）。４．５ 氨水（２５％）。４．６ 盐酸（３６％）。４．７ 乙酸铵。４．８ ０．１％乙酸溶液：量取０．５ｍＬ乙酸（４．４），用水稀释至５００ｍＬ。４．９ ０．１ｍｏｌ／Ｌ盐酸溶液：量取４．２ｍＬ盐酸（４．６），用水稀释至５００ｍＬ。４．１０ ２０ｍｍｏｌ／Ｌ乙酸铵缓冲液（ｐＨ＝４）：准确称取０．７７ｇ乙酸铵溶于５００ｍＬ水中，用乙酸溶液（４．８）调ｐＨ值至４。４．１１ ５％氨水甲醇（５＋９５，体积比）溶液：量取５ｍＬ氨水（４．５），用甲醇稀释至１００ｍＬ。４．１２ ０．１％乙酸乙腈（２＋８，体积比）溶液：量取２００ｍＬ乙酸溶液（４．８），用乙腈稀释至１０００ｍＬ。４．１３ 乙腈饱和的正己烷溶液：２０ｍＬ乙腈中加入１００ｍＬ正己烷，充分振荡后，静置分层，取上层正己烷层备用。４．１４ 无水硫酸钠：经６５０℃灼烧４ｈ，冷却后在干燥器中储存备用。４．１５ 乌洛托品标准物质（Ｕｒｏｔｒｏｐｉｎｅ，分子式：Ｃ６Ｈ１２Ｎ４）：纯度大于９９．０％。４．１６ 标准储备溶液：准确称取按其纯度折算为１００％质量的乌洛托品标准品０．０１０ｇ，用乙腈溶解并定容至１００ｍＬ，浓度相当于１００μｇ／ｍＬ。储备液在０℃～４℃冰箱避光保存，可使用６个月。４．１７ 标准中间溶液：准确量取标准储备溶液（４．１６）１．０ｍＬ，用乙酸乙腈溶液（４．１２）溶解并定容至１犛犖／犜２２２６—２００８食品伙伴网１００ｍＬ，浓度相当于１．０μｇ／ｍＬ，在０℃～４℃冰箱避光保存，使用前配制。４．１８ 标准工作溶液：根据需要用１．０ｍＬ适当浓度的标准工作溶液溶解空白样品浓缩残渣，配制成适当浓度的标准工作溶液，使用前配制。４．１９ 固相萃取柱（ＯａｓｉｓＭＣＸ）：６０ｍｇ，３ｍＬ，或相当者。ＯａｓｉｓＭＣＸ固相萃取柱使用前分别用３ｍＬ甲醇、３ｍＬ水、３ｍＬ乙酸铵溶液预处理，并保持柱体湿润。４．２０ 微孔滤膜：０．２２μｍ，有机相。５ 仪器和设备５．１ 高效液相色谱质谱／质谱仪：配电喷雾离子源（ＥＳＩ）或相当者。５．２ 分析天平：感量为０．１ｍｇ，０．０１ｇ。５．３ 固相萃取装置。５．４ ｐＨ计：测量精度±０．０２。５．５ 旋转蒸发器。５．６ 氮吹仪。５．７ 旋涡混匀器。５．８ 组织捣碎机。５．９ 均质器（１００００ｒ／ｍｉｎ）。５．１０ 离心机（４０００ｒ／ｍｉｎ）。５．１１ ５０ｍＬ玻璃离心管。６ 试样的制备与保存取样品中有代表性的约２００ｇ，用组织捣碎机捣碎，混匀，均分成两份作为试样，分别装入洁净容器，密封并做好标识，于－１８℃冰箱内保存。在抽样和制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。７ 测定步骤７．１ 提取准确称取５ｇ试样（精确到０．０１ｇ）于５０ｍＬ离心管中，加入２ｇ无水硫酸钠、２０ｍＬ乙腈，用均质器以１００００ｒ／ｍｉｎ均质１ｍｉｎ，以４０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，上清液转移至５０ｍＬ具塞离心管中，样品再用１０ｍＬ乙腈重复上述提取、离心操作，合并两次提取的上清液，加入经乙腈饱和的正己烷溶液（４．１３）１０ｍＬ，用漩涡振荡器混匀２ｍｉｎ后，以４０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，弃去上清液，乙腈相过无水硫酸钠，转移至浓缩瓶，浓缩近干后待净化。７．２ 净化用１．０ｍＬ２０ｍｍｏｌ／Ｌ乙酸铵缓冲液（４．１０）溶解浓缩瓶中残渣，以１ｍＬ／ｍｉｎ～２ｍＬ／ｍｉｎ的速度过固相萃取柱（４．１９），再用２．０ｍＬ２０ｍｍｏｌ／Ｌ乙酸铵溶液分两次洗涤浓缩瓶，过固相萃取柱，用１．０ｍＬ水、１．０ｍＬ甲醇依次淋洗固相萃取柱，弃去流出液，在１５ｍｍＨｇ以下减压抽１ｍｉｎ使柱体干涸；用３．０ｍＬ５％氨水甲醇溶液（４．１１）洗脱，洗脱液在４５℃下用氮吹仪浓缩至近干，用１．０ｍＬ０．１％乙酸乙腈溶液（４．１２）溶解残渣，经０．２２μｍ滤膜过滤，供液相色谱质谱／质谱测定。７．３ 测定７．３．１ 液相色谱条件ａ） 色谱柱：ＷａｔｅｒｓＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣ?ＨＩＬＩＣ２．１ｍｍ（内径）×５０ｍｍ，粒径１．７μｍ，或相当者；ｂ） 流动相：０．１％乙酸乙腈（２＋８，体积比）；ｃ） 流速：０．２５ｍＬ／ｍｉｎ或根据仪器条件优化；２犛犖／犜２２２６—２００８食品伙伴网ｄ） 柱温：３０℃；ｅ） 进样量：５μＬ。７．３．２ 质谱条件ａ） 离子源：电喷雾离子源；ｂ） 扫描方式：正离子；ｃ） 检测方式：多反应监测（ＭＲＭ）；ｄ） 其他质谱／质谱参考条件参见附录Ａ中表Ａ．１。７．３．３ 定量测定根据样液中乌洛托品残留量浓度大小，选定峰高相近的标准工作溶液，标准工作溶液和样液中乌洛托品残留的响应值均应在仪器的检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参差进样测定，在上述色谱条件下，乌洛托品的参考保留时间约为３．０６ｍｉｎ，标准溶液的多反应监测色谱图参见附录Ｂ中图Ｂ．１。７．３．４ 定性测定在相同的实验条件下，样品与标准工作液中待测物质的质量色谱峰相对保留时间在２．５％以内，并且在扣除背景后的样品质量色谱图中，所选择的离子对均出现，同时与标准品的相对丰度允许偏差不超过表１规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。表１ 使用定性液相色谱质谱／质谱时相对离子丰度最大容许误差相对离子丰度／％＞５０＞２０～５０＞１０～２０≤１０最大允许偏差／％±２０±２５±３０±５０７．４ 空白试验除不加试样外，均按上述操作步骤进行。８ 结果计算和表述用数据处理软件中的外标法，或绘制标准曲线，按照式（１）计算样品中乌洛托品残留量。犡＝犮×犞犿……………………………（１） 式中：犡———试样中待测组分含量，单位为微克每千克（μｇ／ｋｇ）；犮———由标准曲线而得的样液中待测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ｎｇ／ｍＬ）；犞———样液最终定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；犿———最终样液所代表的试样质量，单位为克（ｇ）。９ 测定低限、回收率９．１ 测定低限本方法乌洛托品测定低限为５μｇ／ｋｇ。９．２ 回收率回收率试验数据见表２。表２ 乌洛托品添加回收率（狀＝１０）食品名称添加浓度／（μｇ／ｋｇ）平均测定值／（μｇ／ｋｇ）回收率／％相对标准偏差／％鸡肉５１０２０３．８３８．３８１６．７０７３．２～８６．７７３．８～９１．５７６．７～９３．６５．５５．１６．３３犛犖／犜２２２６—２００８食品伙伴网表２（续）食品名称添加浓度／（μｇ／ｋｇ）平均测定值／（μｇ／ｋｇ）回收率／％相对标准偏差／％鸡肝５１０２０３．８９８．１２１６．７１７０．１～９１．８７２．２～９３．２７５．７～９２．６８．３７．７６．５鸡肾５１０２０３．８１７．３８１６．１４７０．０～８６．８６９．８～８５．８７５．４～９２．９８．１６．５７．２猪肉５１０２０３．９１８．７０１７．２０７１．４～８４．７７７．３～９７．４７５．９～１０１．１７．４６．４６．６４犛犖／犜２２２６—２００８食品伙伴网附 录 犃（资料性附录）串联质谱条件１） 串联质谱条件：１） 非商业性声明：附录表Ａ所列参数是在ＷａｔｅｒｓＱｕａｔｔｒｏＰｒｅｍｉｅｒ质谱仪上完成的，此处列出试验用仪器型号仅是为了提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试采用不同厂家或型号的仪器。ａ） 电离方式：ＥＳＩ＋；ｂ） 毛细管电压：３．０ｋＶ；ｃ） 源温度：１１０℃；ｄ） 去溶剂温度：３５０℃；ｅ） 锥孔气流：５０Ｌ／ｈ；ｆ） 去溶剂气流：５５０Ｌ／ｈ；ｇ） 碰撞气：氩气，碰撞气压３．３０×１０－３Ｐａ；ｈ） 监测模式：多反应监测条件见表Ａ．１。表犃．１ 多反应监测条件化合物母离子子离子驻留时间／ｓ锥孔电压／Ｖ碰撞能量乌洛托品１４１．１１１２．２ａ０．２２５１３９８．２０．２２５１３ａ离子用于定量。５犛犖／犜２２２６—２００８食品伙伴网附 录 犅（资料性附录）标准样品色谱图 ａ）ｂ）ｃ）图犅．１ 乌洛托品高效液相色谱质谱／质色谱图６犛犖／犜２２２６—２００８食品伙伴网犉狅狉犲狑狅狉犱犃狀狀犲狓犃犪狀犱犃狀狀犲狓犅狅犳狋犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犻狊犻狀犳狅狉犿犪狋犻狏犲犪狀狀犲狓犲狊．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊狆狉狅狆狅狊犲犱犫狔犪狀犱犻狊狌狀犱犲狉狋犺犲犮犺犪狉犵犲狅犳犆犺犻狀犪犖犪狋犻狅狀犪犾犚犲犵狌犾犪狋狅狉狔犆狅犿犿犻狊狊犻狅狀犳狅狉犆犲狉狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱犃犮犮狉犲犱犻狋犪狋犻狅狀．犜犺犲狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊犱狉犪犳狋犲犱犫狔犎犲犻犾狅狀犵犼犻犪狀犵犈狀狋狉狔犈狓犻狋犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲犅狌狉犲犪狌狅犳狋犺犲犘犲狅狆犾犲’狊犚犲狆狌犫犾犻犮狅犳犆犺犻狀犪，犆犺狅狀犵狇犻狀犵犈狀狋狉狔犈狓犻狋犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲犅狌狉犲犪狌狅犳狋犺犲犘犲狅狆犾犲’狊犚犲狆狌犫犾犻犮狅犳犆犺犻狀犪，犔犻犪狅狀犻狀犵犈狀狋狉狔犈狓犻狋犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲犅狌狉犲犪狌狅犳狋犺犲犘犲狅狆犾犲’狊犚犲狆狌犫犾犻犮狅犳犆犺犻狀犪．犜犺犲犿犪犻狀犱狉犪犳狋犲狉狊狅犳狋犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犪狉犲犔犻狌犢狅狀犵，犢犪狀犵犆犺犪狀犵狕犺犻，犠犪狀犵犌狌狅犿犻狀，犓犪狀犵犙犻狀犵犺犲，犔犻狀犠犲犻狓狌犪狀，犔犻犡犻犪狀犾犻犪狀犵，犠狌犢犪狀，犆犺犲狀犵犢犪狀犵，犠犪狀犵犅犻狀犵，犌狌狅犠犲犻．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犻狊犪狆狉狅犳犲狊狊犻狅狀犪犾狊狋犪狀犱犪狉犱犳狅狉犲狀狋狉狔犲狓犻狋犻狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅犿狌犾犵犪狋犲犱犳狅狉狋犺犲犳犻狉狊狋狋犻犿犲．犖狅狋犲：犜犺犻狊犈狀犵犾犻狊犺狏犲狉狊犻狅狀，犪