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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２２０６．２—２００９化妆品微生物检验方法第２部分：需氧芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犿犻犮狉狅犫犻狅犾狅犵犻犮犪犾犻狀犮狅狊犿犲狋犻犮狊—犘犪狉狋２：犃犲狉狅犫犻犮狊狆狅狉犲犳狅狉犿犲狉犫犪犮狋犲狉犻犪犪狀犱犅犪犮犻犾犾狌狊犮犲狉犲狌狊２００９０２２０发布２００９０９０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 ＳＮ／Ｔ２２０６《化妆品微生物检验方法》分为以下部分：———第１部分：沙门氏菌；———第２部分：需氧芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌；———第３部分：肺炎克雷伯氏菌；———第４部分：链球菌；———第５部分：肠球菌。本部分为ＳＮ／Ｔ２２０６的第２部分。本部分的附录Ａ和附录Ｂ均为资料性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本部分主要起草人：杨捷琳、顾鸣、韩伟、黄玲、许龙岩。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２２０６．２—２００９化妆品微生物检验方法第２部分：需氧芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌１ 范围ＳＮ／Ｔ２２０６的本部分规定了化妆品中尤其是水分含量较少的粉类化妆品中需氧芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的检验方法。本部分适用于化妆品中需氧芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的检验。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过ＳＮ／Ｔ２２０６的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。ＧＢ／Ｔ７９１８．１ 化妆品微生物标准检验方法 总则ＳＮ／Ｔ０１７６ 出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法３ 材料和设备３．１ 三角瓶：２５０ｍＬ。３．２ 玻璃珠。３．３ Ｌ形玻璃棒。３．４ 刻度吸管：１ｍＬ，１０ｍＬ。３．５ 均质器。３．６ 恒温培养箱：３６℃±１℃，３０℃±１℃，３２℃±２．５℃。３．７ 高压灭菌器。３．８ 振荡器。４ 培养基和试剂４．１ Ｄ／Ｅ中和培养基（Ｄｅｙ／Ｅｎｇｌｅｙ中和培养基），见附录Ａ第Ａ．１章。４．２ 甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基（ＭＹＰ），见附录Ａ第Ａ．２章。４．３ 葡萄糖蛋白胨琼脂（ＤＴ培养基，加中和剂），见附录Ａ第Ａ．３章。４．４ ＡＰＩ检测试纸条或其他等效产品注：ＡＰＩ测试条是由法国梅里埃公司提供的产品的商品名，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的唯一认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。５ 检验程序５．１ 化妆品中需氧芽孢杆菌检验流程图见图１。１犛犖／犜２２０６．２—２００９图１ 化妆品中需氧芽孢杆菌检验流程图５．２ 化妆品中蜡样芽孢杆菌检验流程图见图２。图２ 化妆品中蜡样芽孢杆菌检验流程图５．３ 样品制备样品参照ＧＢ／Ｔ７９１８．１供检样品的制备方法进行。样品制备时，也可参照附录Ａ第Ａ．１章的Ｄ／Ｅ中和培养基代替生理盐水或ＳＣＤＬＰ培养基。参照附录Ｂ中列出的化妆品中常用防腐剂种类及微生物检验时所使用的中和剂种类和配方，可根据不同产品成分参照使用。５．４ 取１∶１０稀释液１０．０ｍＬ加入到含有９０．０ｍＬ生理盐水的稀释瓶中，置３０℃±１℃水浴中１５ｍｉｎ，经常振摇，取出后静置１５ｍｉｎ，取上清液１０．０ｍＬ制成１∶１００的稀释液，每个稀释度换用一支１０．０ｍＬ无菌吸管，按上述操作程序递增十倍稀释至合适浓度。５．５ 需氧芽孢菌计数５．５．１ 移取合适浓度样品悬液１０ｍＬ，搅拌加入融化的葡萄糖蛋白胨琼脂１００ｍＬ，混合均匀，沸水浴１５ｍｉｎ，轻微搅拌冷却至５０℃～６０℃，再将混合物等量倾注５块平板，待凝固后表面覆盖一薄层２％灭菌琼脂（防止蔓延型菌落出现），待覆盖琼脂凝固后，倒置３０℃±１℃，培养５ｄ。２犛犖／犜２２０６．２—２００９５．５．２ 选取平板上１０个以上菌落，进行革兰氏染色镜检，芽孢菌应为革兰氏阳性杆菌，有明显芽孢体存在，氧化酶、触酶实验，需氧芽孢菌多为阴性，进一步采用ＡＰＩ等生化鉴定试剂条进行鉴定。５．５．３ 计数：计数五个平板上的菌落数，相加，乘以稀释倍数，即为每克（毫升）［ｇ（ｍＬ）］化妆品中需氧芽孢总数。５．６ 蜡样芽孢杆菌计数５．６．１ 取各稀释液０．１ｍＬ分别接种到ＭＹＰ琼脂平板和葡萄糖蛋白胨琼脂平板，用无菌Ｌ形玻璃棒均匀涂布于整个琼脂表面，每个稀释度各接种两块平板。５．６．２ 平板置于３０℃±１℃培养２４ｈ±２ｈ。５．６．３ 蜡样芽孢杆菌在ＭＹＰ琼脂平板上生成的菌落为微粉红色，环绕产生卵磷脂酶沉淀环，如反应不典型，可继续培养２４ｈ再计数。５．７ 革兰氏染色：挑取上述可疑菌落，染色镜检，蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性大杆菌，呈长链或短链，芽孢呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不使菌体胀大。５．８ 镜检后，挑取可疑菌落分别接种营养琼脂斜面，于３０℃培养２４ｈ，按照ＳＮ／Ｔ０１７６进行证实实验。５．９ 计数及报告：选取具有１５个～１５０个已确证为蜡样芽孢杆菌菌落的平板进行计数，并计算同一稀释度两个平板的平均菌落数，结果报告。６ 中和剂验证６．１ 微生物菌株采用蜡样芽孢杆菌（ＡＴＣＣ１１７７８）或其他等同性菌株。６．２ 验证实验６．２．１ 接种物的制备，在测试前，用蜡样芽孢杆菌（ＡＴＣＣ１１７７８）接种葡萄糖琼脂（ＤＴ）培养基，３２．５℃±２．５℃培养１８ｈ～２４ｈ。收集培养物，调整悬液浓度为１０８ＣＦＵ／ｍＬ。注：在２ｈ内使用制备的悬液和稀释液。６．２．２ 梯度稀释菌悬液，以获得１００ＣＦＵ／ｍＬ与５００ＣＦＵ／ｍＬ之间的浓度。为了计数调整的菌悬液中的活菌数量，移取１ｍＬ悬液放入平皿内，混皿法倾注平板，倒置３２．５℃±２．５℃培养２０ｈ～２４ｈ计数。６．２．３ 取样品１ｇ或１ｍＬ，按照ＧＢ／Ｔ７９１８．１供检样品的方法１∶１０制备样液，无菌方式加入０．１ｍＬ调整好浓度的菌悬液；未添加细菌的样品作为对照。６．２．４ 划线分离于添加中和剂（ＤＴ＋）和未添加中利剂（ＤＴ－）的平板，３２．５℃±２．５℃培养２０ｈ～２４ｈ。６．３ 验证结果的解释如果ＤＴ（＋）平板上有标准菌株生长，在ＤＴ（－）平板上不生长，中和剂的中和效果得以验证。当ＤＴ（＋）和ＤＴ（－）上均有细菌生长，如果ＤＴ（＋）生长菌株为添加的标准菌株时，中和剂的中和效果得以验证。在ＤＴ（＋）和ＤＴ（－）无细菌生长或仅ＤＴ（－）有杂菌生长均表明抗菌活性仍然存在，应改变样品与培养基稀释比例，或改变中和剂配方，进一步选择合适的中和剂配方，验证中和效果。３犛犖／犜２２０６．２—２００９附 录 犃（资料性附录）培养基犃．１ 犇／犈中和培养基（犇犲狔／犈狀犵犾犲狔中和培养基）犃．１．１ 成分葡萄糖 １０．０ｇ大豆磷脂７．０ｇ五水硫代硫酸钠６．０ｇ聚山梨醇酯８０８０５．０ｇ胰化酪蛋白５．０ｇ亚硫酸氢钠２．５ｇ酵母膏２．５ｇβ巯基乙醇１．０ｇ溴甲酚紫０．０２ｇ蒸馏水１０００ｍＬｐＨ７．３±０．１犃．１．２ 制法将各组分依次称取加入，加热后使之完全溶解，１２１℃灭菌１５ｍｉｎ，使用时，调节ｐＨ值至７．６±０．２。犃．２ 甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基（犕犢犘）犃．２．１ 成分Ａ成分牛肉膏１．０ｇ蛋白胨１０．０ｇ犇甘露醇１０．０ｇ氯化钠１０．０ｇ琼脂１５．０ｇ酚红０．０２５ｇ蒸馏水１０００ｍＬｐＨ７．２±０．１Ｂ成分：５０％卵黄液５０ｍＬＣ成分：多粘菌素Ｂ１００ＩＵ／ｍＬ犃．２．２ 制法将Ａ成分中各组分依次称取加入，加热后使之完全溶解，校正ｐＨ至ｐＨ７．２±０．１，加入酚红溶液，混匀后分装烧瓶，１２１℃灭菌１５ｍｉｎ，冷却至５０℃后每升加入５０ｍＬ５０％卵黄液（Ｂ成分）和２．５ｍＬ多粘菌素Ｂ（Ｃ成分）。犃．３ 葡萄糖蛋白胨琼脂（ＤＴ培养基，加中和剂）犃．３．１ 成分酪蛋白胨１０ｇ４犛犖／犜２２０６．２—２００９葡萄糖５ｇ２％溴甲酚紫乙醇溶液２ｍＬ琼脂１５ｇ卵磷脂１ｇ吐温８０７ｇ蒸馏水１０００ｍＬｐＨ６．７±０．２犃．３．２ 覆盖琼脂琼脂２０ｇ蒸馏水１０００ｍＬ犃．３．３ 制法将各组分依次称取加入，加热后使之完全溶解，１２１℃灭菌１５ｍｉｎ，使用时，调节ｐＨ值至６．７±０．２。５犛犖／犜２２０６．２—２００９附 录 犅（资料性附录）防腐剂对应使用中和剂清单表犅．１ 防腐剂对应使用中和剂清单防 腐 剂中 和 剂中和剂及漂洗液配方（膜过滤法） 酚类化合物 对羟基苯甲酸酯，苯基乙醇，苯胺 卵磷脂，聚山梨醇酯８０，脂肪酸环氧乙烷聚合物，非离子型表面活性剂 聚山梨醇酯８０，３０ｇ／Ｌ＋卵磷脂，３ｇ／Ｌ。 脂肪酸环氧乙烷聚合物，７ｇ／Ｌ＋卵磷脂，２０ｇ／Ｌ＋聚山梨醇酯８０，４ｇ／Ｌ。 Ｄ／Ｅ中和培养基ａ 漂洗液：蒸馏水；蛋白胨，１ｇ／Ｌ＋氯化钠，９ｇ／Ｌ；聚山梨醇酯８０，５ｇ／Ｌ。 季胺类化合物，阳离子表面活性剂 卵磷脂卵磷脂，皂角苷，聚山梨醇酯８０，十二烷基硫酸钠，脂肪酸环氧乙烷聚合物 聚山梨醇酯８０，３０ｇ／Ｌ＋十二烷基硫酸钠，４ｇ／Ｌ＋卵磷脂，３ｇ／Ｌ。 聚山梨醇酯８０，３０ｇ／Ｌ＋皂角苷，３０ｇ／Ｌ＋卵磷脂，３ｇ／Ｌ。 Ｄ／Ｅ中和培养基ａ 漂洗液：蒸馏水；蛋白胨，１ｇ／Ｌ＋氯化钠，９ｇ／Ｌ；聚山梨醇酯８０，５ｇ／Ｌ。 甲醛 乙醛 甘氨酸，组氨酸 卵磷脂，３ｇ／Ｌ＋聚山梨醇酯８０，３０ｇ／Ｌ＋Ｌ组氨酸，１ｇ／Ｌ。 聚山梨醇酯８０，３０ｇ／Ｌ＋皂角苷，３０ｇ／Ｌ＋Ｌ组氨酸，１ｇ／Ｌ＋Ｌ半胱氨酸，１ｇ／Ｌ。 Ｄ／Ｅ中和培养基ａ 漂洗液：聚山梨醇酯８０，３ｇ／Ｌ＋Ｌ组氨酸，０．５ｇ／Ｌ。 氧化物 硫代硫酸钠 硫代硫酸钠，５ｇ／Ｌ。 漂洗液：硫代硫酸钠，３ｇ／Ｌ。 异噻唑啉酮，咪唑 卵磷脂，皂角苷，胺，硫醇，亚硫酸氢钠，β巯基乙醇 聚山梨醇酯８０，３０ｇ／Ｌ＋皂角苷，３０ｇ／Ｌ＋卵磷脂，３ｇ／Ｌ。 漂洗液：蛋白胨，１ｇ／Ｌ＋氯化钠，９ｇ／Ｌ；聚山梨醇酯８０，５ｇ／Ｌ。 双胍 卵磷脂，皂角苷，聚山梨醇酯８０ 聚山梨醇酯８０，３０ｇ／Ｌ＋皂角苷，３０ｇ／Ｌ＋卵磷脂，３ｇ／Ｌ。 漂洗液：蛋白胨，１ｇ／Ｌ＋氯化钠，９ｇ／Ｌ；聚山梨醇酯８０，５ｇ／Ｌ。 金属盐类（Ｃｕ，Ｚｎ，Ｈｇ），有机汞类 重硫酸钠，Ｌ巯基半胱氨酸，β巯基乙醇 β巯基乙醇，０．５ｇ／Ｌ或５ｇ／Ｌ。 Ｌ半胱氨酸，０．８ｇ／Ｌ或１．５ｇ／Ｌ。 Ｄ／Ｅ中和培养基ａ 漂洗液：β巯基乙醇，０．５ｇ／Ｌ。６犛犖／犜２２０６．２—２００９书书书９００２—２．６０２２犜／犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准化妆品微生物检验方法第２部分：需氧芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌ＳＮ／Ｔ２２０６．２—２００９中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张０．７５ 字数１２千字２００９年５月第一版 ２００９年５月第一次印刷印数１—２０００书号：１５５０６６·２１９６４７ 定价１６．００元