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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２１６４—２００８危险品急性经口毒性固定剂量试验方法犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳犪犮狌狋犲狅狉犪犾狋狅狓犻犮犻狋狔—犉犻狓犲犱犱狅狊犲犿犲狋犺狅犱犳狅狉犱犪狀犵犲狉狅狌狊犵狅狅犱狊２００８０９０４发布２００９０３１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言本标准修改采用联合国经济合作与发展组织（ＯＥＣＤ）化学品测试方法Ｎｏ．４２０《急性经口毒性：固定剂量法》（２００１）。本标准与ＯＥＣＤ化学品测试方法Ｎｏ．４２０相比，存在以下差异：———对ＯＥＣＤ化学品测试方法Ｎｏ．４２０进行了编辑性修改；———增加了前言部分；———增加了附录部分。本标准附录Ａ、附录Ｂ和附录Ｃ为规范性附录。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本标准由国家认证认可监督管理委员会归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准参加起草单位：江南大学、中化化工标准化研究所、天津市检验检疫科学技术研究院。本标准主要起草人：李宁涛、张园、庞震、李学洋、于智睿、赵琢。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２１６４—２００８危险品急性经口毒性固定剂量试验方法１ 范围本标准规定了危险化学品急性经口毒性试验的试验原则与程序、试验步骤、数据与报告以及结果解释。本标准适用于对危险化学品进行急性经口毒性的测定。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ１４９２４．１ 实验动物 配合饲料通用质量标准ＧＢ１４９２５ 实验动物 环境及设施３ 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。３．１急性经口毒性 犪犮狋狌犲狅狉犪犾狋狅狓犻犮犻狋狔将受试物在２４ｈ内给试验动物进行一次经口或多次经口染毒时所产生的有害效应。３．２剂量 犱狅狊犲动物给以受试物染毒的量，亦称（一次）剂量，常以动物每千克体重的受试物质量（即ｍｇ／ｋｇ体重）表示其染毒量；如将受试物掺入饲料中进行喂养染毒时，常以受试物浓度的比例（ｍｇ／ｋｇ或ｍｇ／Ｌ）表示。包括染毒的物质量、每天染毒频数及染毒持续时间的总称。３．３明显毒性 犲狏犻犱犲狀狋狋狅狓犻犮犻狋狔动物给以受试物染毒后出现清楚的毒性反应。这些毒性反应足以进行危害评价，并能预测产生严重的毒性反应和可能发生的死亡。４ 试验原则与程序４．１ 试验原则在正式试验中只选用中等毒性剂量，不选用致死剂量，也不选择由腐蚀或严重刺激作用引起的或已知会产生明显疼痛或痛苦的染毒剂量。在测试毒性时，如果发现动物出现明显的疼痛或严重痛苦的症状时，从人道原则出发将其处死。４．２ 试验程序试验中各组选用同性别（一般用雌性）动物，以固定的剂量间距（５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ和２０００ｍｇ／ｋｇ，如有特殊需要再考虑５０００ｍｇ／ｋｇ）顺次进行经口染毒。所选剂量范围应由预试验得知，而且应恰好低于预期发生死亡的剂量。如果在所选剂量中未观察到确认的毒性反应，应选择下一个较高的剂量进行急性毒性试验。如果在起始剂量时已见到动物死亡或严重的毒性反应时，从动物福利考１犛犖／犜２１６４—２００８虑，应选择下一个较低的剂量进行试验。５ 试验步骤５．１ 试验动物５．１．１ 动物的选择大鼠为首选。试验动物体重变异不应超过平均体重的２０％。常用体重范围：大鼠为１８０ｇ～２４０ｇ，小鼠为１８ｇ～２５ｇ。在缺乏构效关系或无提示雄性为更敏感性别动物的前提下，一般选用雌性动物进行试验。５．１．２ 动物饲养条件试验动物的饲养和环境设施应符合ＧＢ１４９２４．１和ＧＢ１４９２５有关规定。５．１．３ 动物的准备———试验前要对动物进行标记，用于随机分组；———至少需要５ｄ时间适应环境；———染毒前，大鼠要禁食（不禁水）过夜，小鼠要禁食（不禁水）３ｈ～４ｈ；———染毒后大鼠要禁食３ｈ～４ｈ，小鼠需禁食１ｈ～２ｈ。５．２ 受试物５．２．１ 受试物准备应将受试物溶解或做成悬浮液等，做成适合于灌胃的物质样品。５．２．２ 溶剂选择一般选择水，其次为植物油，然后是其他无毒、不与受试物发生化学反应和不影响受试物吸收的溶剂或助溶剂。５．３ 染毒步骤首先进行预试验，用一只动物，确定正式试验的染毒剂量，然后按要求将动物随机分组，给各试验动物组进行经口染毒。对于啮齿类动物，固体物质灌胃的剂量最好小于１ｍＬ／１００ｇ，液体物质最好小于２ｍＬ／１００ｇ。５．４ 预试验５．４．１ 起始剂量根据相关的毒理学资料从５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ和２０００ｍｇ／ｋｇ中选择一个作为起始剂量。如果无相关的毒理学资料，一般以３００ｍｇ／ｋｇ作为起始剂量。如果无明确的资料可以证明急性毒性试验对人类、动物健康和环境保护有重大意义，出于动物福利的考虑，应不做５０００ｍｇ／ｋｇ，见附录Ａ。５．４．２ 染毒步骤每次取一只动物，按照附录Ｂ进行预试验，仔细观察并记录染毒后动物的毒性表现，间隔２４ｈ后，再给另一只动物染毒。所有试验动物至少观察１４ｄ。５．４．３ 结果解释５．４．３．１ 一般结果预试验结果为正式试验提供起始剂量。５．４．３．２ 附加程序预试验中，如果在最低剂量（５ｍｇ／ｋｇ）试验动物发生死亡，根据试验程序，应停止试验，将该物质划为全球化学品分类与标签协调体系（ＧＨＳ）急性毒性，危险类别为１类（见附录Ｂ）。但为了获取更为确证的试验结果，应选取第二只试验动物按照５ｍｇ／ｋｇ染毒，如果第二只动物死亡，结束试验，该物质划为ＧＨＳ急性毒性，危险类别为１类；如果该动物无死亡，最多再选三只顺序按５ｍｇ／ｋｇ染毒。出于动物福利的考虑，应一只一只动物顺序试验，观察间隔为确定上一只动物已经存活。只要有第二只动物死２犛犖／犜２１６４—２００８亡则试验结束（此时已经可以按照附录Ｃ进行分级）。５．５ 正式试验５．５．１ 剂量选择从预试验中选取只产生明显毒性而不引起死亡的剂量作为正式试验起始剂量。如果在正式试验时选择的起始剂量未见明显毒性，应接着进行下一个较高剂量的染毒。如果在正式试验时选择的起始剂量中试验动物死亡或严重毒性反应时，应从保护动物免受痛苦出发，选择下一个较低剂量进行试验。５．５．２ 数量每个剂量组５只，５只动物应包含预试验中该剂量组使用的１只动物。５．５．３ 染毒步骤５．５．３．１ 一般程序在预试验所得结果的基础上，遵照附录Ｃ的程序进行染毒。５．５．３．２ 染毒时间间隔应在确定前一剂量组的动物存活后，才可进行下一剂量的试验。一般两个剂量组试验之间要间隔３ｄ～４ｄ，以有助于更好地观察迟发的毒性反应。间隔时间可以根据实际情况进行调整。５．５．４ 限度试验如果有相关的资料表明受试物可能无毒，可以进行限度试验，按照附录Ｃ程序，染毒剂量为２０００ｍｇ／ｋｇ（５０００ｍｇ／ｋｇ，见附录Ａ），若无毒性，应终止试验。５．６ 临床观察和检查５．６．１ 观察频率和期限在给动物染毒的当天应该在染毒后的３０ｍｉｎ和４ｈ各做一次仔细的临床观察，以后每天一次。除非动物过度痛苦需及时处死外，一般在染毒后应对动物观察１４ｄ。观察期一般取决于毒性反应、发生体征的快慢和恢复时间的长短。如果中毒体征有迟发性倾向时，应延长观察期。５．６．２ 观察内容５．６．２．１ 体重应在染毒后称重每只动物，以后至少每周一次，并做好体重记录，计算体重变化。５．６．２．２ 大体观察包括皮肤，被毛，眼睛和粘膜变化，呼吸、循环、植物神经和中枢神经系统的体征，肢体活动状况，行为变化，出现中毒体征时间和消失时间。因人道原因处死动物或发现死亡时，应尽可能准确记录死亡时间。５．６．２．３ 动物福利在染毒后的头几天应经常观察，以便及时发现首选剂量是否过高。如果剂量过高应终止试验。当动物出现明显疼痛和严重痛苦表现时应处死该动物。５．７ 病理组织学检查应对全部染毒动物（包括试验期间死亡的或因人道原因处死的动物）进行大体解剖；记录全部肉眼可见的病损。染毒后存活２４ｈ以上的动物中出现明显肉眼所见病损的器官应作病理组织学检查。６ 数据与报告６．１ 结果处理在预试验和正式试验中，按各剂量水平将染毒动物的观察结果以表格形式进行总结；描述出现中毒体征的动物数，试验中引起死亡的动物数，处死的动物数及毒性反应；在正式试验中是否观察到明显毒性反应，所见任何毒性反应的时间以及肉眼剖查的结果，也应一一加以描述。６．２ 结果评价按照附录Ｃ进行ＧＨＳ分类定级。３犛犖／犜２１６４—２００８６．３ 试验报告试验报告应包括预试验和正式试验所得的下述资料：———受试物的有关理化性质及鉴定资料；———溶剂：所用赋形剂（包括溶剂、助溶剂、乳化剂等）；———试验条件：所用试验动物的品、系，动物数，动物年龄和性别，动物来源，饲养条件和饲料等以及开始试验时动物的体重；———按动物性别和剂量水平（例如，所用动物数，出现中毒体征和死亡的动物数），描述体征的性质，轻重程度和毒性效应及持续时间；———中毒体征起始和发展的时间、过程及恢复情况；———肉眼剖查结果和病理组织学检查结果；———对确定产生明显毒性剂量依据的说明。７ 结果解释应对结果进行适当的讨论和解释，包括提出估算的最小致死量和不引起动物死亡的最高剂量。并对其按照ＧＨＳ进行危险类别分类（遵照附录Ｃ）。４犛犖／犜２１６４—２００８附 录 犃（规范性附录）试验剂量在２０００犿犵／犽犵的分类说明犃．１ 对于犔犇５０大于２０００犿犵／犽犵无需试验的受试物的分类标准犃．１．１ ＧＨＳ分类急性毒性危险类别为５的物质具有相对较低的急性毒性，在某些特定的情况下可能对某些比较脆弱的人群带来危险。这类物质经口或经皮ＬＤ５０值预计在２０００ｍｇ／ｋｇ～５０００ｍｇ／ｋｇ，或其他染毒途径获得的类似结果。犃．１．２ 在下列情况下，受试物可以划为２０００ｍｇ／ｋｇ＜ＬＤ５０＜５０００ｍｇ／ｋｇ（ＧＨＳ具有急性毒性，危险类别为５）：犃．１．２．１ 通过附录Ｃ的试验步骤，根据致死率可以直接将受试物划分到第５类物质。犃．１．２．２ 有确定的证据表明受试物的ＬＤ５０在２０００ｍｇ／ｋｇ＜ＬＤ５０＜５０００ｍｇ／ｋｇ范围内，或者其他动物试验以及人类毒性反应表明该物质对人类健康具有急性毒性。犃．１．２．３ 具有下列任意一种情况，且通过对数据的外推、预测或衡量不能将该物质划分到更为严重的毒性物质：———在急性毒性类别４的经口毒性试验中具有致死性；———在按照急性毒性类别４试验时专家判断出现了较为严重的毒性反应，除了腹泻，竖毛或不太明显的症状；———通过专家对其他动物试验的判断认为有足够的证据表明该物质有比较明显的潜在急性毒性；———有其他动物试验以及人类毒性反应表明该物质对人类具有毒性效应。犃．２ 试验剂量大于２０００犿犵／犽犵只有在特殊情况下才使用５０００ｍｇ／ｋｇ的剂量。如果无明确的资料可以证明做５０００ｍｇ／ｋｇ的试验对人类、动物健康和环境保护有重大意义，出于动物福利的考虑，不做５０００ｍｇ／ｋｇ。犃．３ 预试验附录Ｂ中的试验准则适用于５０００ｍｇ／ｋｇ。如果预试验开始于５０００ｍｇ／ｋｇ，结果为Ａ，应用第二只动物在２０００ｍｇ／ｋｇ剂量开始试验；如果出现了结果Ｂ或Ｃ（明显毒性或无毒性）则选取５０００ｍｇ／ｋｇ作为正式试验的起始剂量。对于在２０００ｍｇ／ｋｇ剂量的试验结果出现Ｂ或Ｃ，应将试验推进到５０００ｍｇ／ｋｇ，如果５０００ｍｇ／ｋｇ的试验结果为Ａ，则正式试验的起始剂量为２０００ｍｇ／ｋｇ，如果结果为Ｂ或Ｃ，则正式试验的起始剂量为５０００ｍｇ／ｋｇ。犃．４ 正式试验附录Ｃ的试验准则适用于５０００ｍｇ／ｋｇ。如果正式试验开始于５０００ｍｇ／ｋｇ，结果Ａ（≥２只死亡）需要选第二组动物在２０００ｍｇ／ｋｇ上进行试验；如果出现结果Ｂ［明显毒性和（或）≤１只死亡］或Ｃ（无毒性）表明该受试物不能按照ＧＨＳ的标准进行划分类别。在２０００ｍｇ／ｋｇ剂量上的试验出现结果Ｂ或Ｃ，应将试验推进到５０００ｍｇ／ｋｇ，如果５