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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２１６８—２００８危险品生殖毒性试验方法犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳狉犲狆狉狅犱狌犮狋犻狅狀狋狅狓犻犮犻狋狔犳狅狉犱犪狀犵犲狉狅狌狊犵狅狅犱狊２００８０９０４发布２００９０３１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言本标准修改采用联合国经济合作与发展组织（ＯＥＣＤ）化学品测试方法Ｎｏ．４１５《一代繁殖毒性试验》（１９８３）、Ｎｏ．４１６《两代繁殖毒性试验》（２００１）。本标准与ＯＥＣＤ化学品测试方法Ｎｏ．４１５、Ｎｏ．４１６相比，存在以下差异：———对ＯＥＣＤ化学品测试方法Ｎｏ．４１５、Ｎｏ．４１６进行了编辑性修改；———增加了前言部分。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本标准由国家认证认可监督管理委员会归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准参加起草单位：中化化工标准化研究所、江南大学、天津市检验检疫科学技术研究院。本标准主要起草人：李宁涛、张园、周磊、于智睿、熊中强、赵黎华。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２１６８—２００８危险品生殖毒性试验方法１ 范围本标准规定了危险化学品生殖毒性试验的试验方法和试验结果。本标准适用于对危险化学品进行生殖毒性的测定。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ１４９２４．１ 实验动物 配合饲料通用质量标准ＧＢ１４９２５ 实验动物 环境及设施３ 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。３．１生殖 狉犲狆狉狅犱狌犮狋犻狅狀人和哺乳动物繁衍种族的复杂的生理过程，包括两性生殖细胞或称配子的发生、配子的释放、性周期和性行为、卵细胞受精、受精卵的卵裂、胚泡形成、着床、胚胎形成、胚胎发育、器官形成、胎儿发育、分娩和哺乳、出生后发育直至性成熟并繁殖下一代的过程。３．２生殖毒性 狉犲狆狉狅犱狌犮狋犻狅狀狋狅狓犻犮犻狋狔化学毒物对生殖系统产生的不良效应，包括对父母双方和对胚胎、新生儿的损害。４ 试验方法４．１ 试验器材和试剂４．１．１ 器材灌胃针、注射器及针头、外科手术剪、手术刀、无齿镊、电子天平、动物体重秤。４．１．２ 试剂蒸馏水、生理盐水或二甲基亚砜等溶剂。４．２ 试验动物选用大鼠，每一剂量组至少２０只雌鼠、１０只雄鼠。试验动物饲养条件应符合ＧＢ１４９２４．１和ＧＢ１４９２５有关规定。４．３ 剂量和分组将试验动物随机至少分为两个剂量组和一个对照物。最高剂量应使亲代动物出现明显的毒性反应，但不引起动物死亡；低剂量应不引起亲代及其子代动物的任何毒性反应。如果受试样品的毒性较低，１０００ｍｇ／ｋｇ体重的剂量仍未对繁殖过程有任何毒副作用，则可以采用限量试验，即试验不需要设其他剂量组。若高剂量的预试验观察到明显的母体毒性作用，但对生育无影响，也可以采用限量试验。１犛犖／犜２１６８—２００８４．４ 染毒方法４．４．１ 一代繁殖试验———雄性动物：在交配前６０ｄ开始染毒，覆盖从精原细胞到精子的整个发育过程；———雌性动物：至少要在交配前１６ｄ染毒，染毒期要覆盖卵子发育期、怀孕期和哺乳期。４．４．２ 二代繁殖试验按照表１的程序进行染毒。表１ 二代繁殖毒性试验染毒程序时间／ｄＦ０Ｆ１０Ｆ０出生—３０Ｆ０离乳—４０Ｆ０开始染毒（连续染毒１００ｄ）—１４０Ｆ０交配—１６０Ｆ１出生—２００Ｆ１离乳Ｆ０染毒结束Ｆ１开始染毒（连续染毒１２０ｄ）３２０—Ｆ１交配３４０—Ｆ２出生３８０—Ｆ２离乳４１０—Ｆ１染毒结束，病理解剖 注：Ｆ０为亲代，Ｆ１为子１代，Ｆ２为子２代。４．４．３ 交配方法及妊娠检查雄性和雌性动物按１∶１或１∶２的比例进行交配。雌鼠应始终与同剂量组的同一只，但不是同窝所生的雄鼠合笼直至受孕，合笼最长时间可为３周。在交配过程中，每天早晨应对雌鼠进行检查，查看有无阴栓或阴道中是否有精子。将检查到精子或阴栓的当天计为雌鼠妊娠的第０天。４．４．４ 每窝新生幼鼠数量的调整Ｆ１代出生后的第４天，应将仔鼠数尽量随机调整到每窝４雌和４雄。若得不到４雌和４雄时可作不均等的调整（如５雄３雌）。每窝的幼仔数小于８只时，可不进行调整。Ｆ２子代按同样的方法进行调整。５ 试验结果５．１ 观察记录检查记录活仔数和死仔数、性别比和产生畸形活仔的雌性动物数。５．１．１ 体重参与繁殖的动物（亲代和Ｆ１子代）应在染毒的第１天进行称量，以后每周称量体重一次。数据应逐只进行记录。产仔后，每窝仔鼠需要称量体重时，母鼠的食物摄入量也应同时计算。以每窝为单位，对仔鼠于出生的当天上午、第４天、第７天、第１４天和第２１天进行称量。５．１．２ 大体观察每日至少对动物进行一次仔细的观察。记录有无行为改变、难产或滞产以及所有的毒性反应（包括死亡）。在交配前和交配期，应计算每周的食物摄入量，在妊娠中可考虑逐日记录。交配结束时，采集亲代雄鼠附睾的精子，显微镜下计数２００个精子，观察其活动性、形状及数量。５．１．３ 妊娠观察妊娠周期应该从怀孕的第０天开始计算。生产下的仔鼠应尽早分辨性别，记录每窝的出生数、活仔２犛犖／犜２１６８—２００８数以及幼仔外观有无异常和畸形。同时记录母鼠或仔鼠在生理上和行为上的异常表现。５．１．４ 大体解剖死亡和到期处死的亲代和成年的Ｆ１子代动物都应解剖进行大体检查，肉眼观察有无组织器官形态上的改变，特别是生殖器官。死亡或濒临死亡的仔鼠也应接受检查，查看是否有外观或器官形态的缺陷。５．１．５ 病理组织学检查保留上述剖检的所有亲代和Ｆ１子代动物的卵巢、子宫、子宫颈、阴道、睾丸、附睾、精囊、前列腺、脑下垂体和靶器官标本。先对最高剂量组和对照组的动物标本以及剖检中发现异常的标本进行组织病理学检查。如最高剂量组没有发现有意义的病变，其他剂量组的标本可不必再进行病理检查。反之，若最高剂量组发现有意义的病理改变，则其他剂量组相关的标本也应作进一步的检查。５．２ 结果计算５．２．１ 生育力指数按式（１）计算：受孕率＝妊娠雌鼠数交配雌鼠数×１００％……………………………（１）５．２．２ 受孕指数按式（２）计算：正常妊娠率＝正常分娩的雌鼠数妊娠雌鼠数×１００％………………………（２）５．２．３ 存活力指数按式（３）计算：出生存活率＝出生后４ｄ存活幼仔数出生当时存活幼仔数×１００％………………………（３）５．２．４ 其他指标———交配指数（交配占发情周期的百分率）；———雌性生育力指数（妊娠雌鼠数占接触育龄雄鼠的雌鼠总数的百分率）；———雌性生殖率指数（使雌鼠受孕的雄鼠数占与育龄未孕雌鼠接触的雄鼠总数的百分率）；———生后２４ｈ、１２ｄ的存活指数。５．３ 数据处理数据可以用表格进行统计，表中应显示每组的试验动物数、交配的雄性动物数、受孕的雌性动物数、各种毒性反应及其出现动物的百分数。５．４ 结果评价逐一比较剂量组动物与对照组动物繁殖指数是否有显著性差异，以评定受试样品有无生殖毒性，同时还可根据统计学差异出现在哪个指标上（如体重、观察指标、大体解剖和病理组织学检查结果等），进一步评价生殖毒性的损害作用特点。犛犖／犜２１６８—２００８