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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２１７７—２００８危险品哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验方法犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳犻狀狏犻狏狅犿犪犿犿犪犾犻犪狀犫狅狀犲犿犪狉狉狅狑犮犺狉狅犿狅狊狅犿犲犪犫犲狉狉犪狋犻狅狀犳狅狉犱犪狀犵犲狉狅狌狊犵狅狅犱狊２００８０９０４发布２００９０３１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准修改采用联合国经济合作与发展组织（ＯＥＣＤ）化学品测试方法Ｎｏ．４７５《哺乳动物骨髓染色体畸变试验》（１９９７）。本标准与ＯＥＣＤ化学品测试方法Ｎｏ．４７５相比，存在以下差异：———对ＯＥＣＤ化学品测试方法Ｎｏ．４７５进行了编辑性修改；———增加了前言部分；———增加了定义部分；———删掉了试验报告部分。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本标准由国家认证认可监督管理委员会归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准参加起草单位：中化化工标准化研究所。本标准主要起草人：张园、赵好力宝、于智睿、赵琢、熊中强、李学洋。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２１７７—２００８危险品哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验方法１ 范围本标准规定了体内哺乳动物骨髓染色体畸变试验的术语和定义、试剂和仪器、试验方法、试验结果及结果评价。本标准适用于检测化学品对骨髓细胞的致突变性。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ１４９２４．１ 实验动物 配合饲料通用质量标准ＧＢ１４９２５ 实验动物 环境及设施卫生部《消毒技术规范》３ 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。３．１染色单体型畸变 犮犺狉狅犿犪狋犻犱狋狔狆犲犪犫犲狉狉犪狋犻狅狀染色体结构损伤，表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤。３．２染色体型畸变 犮犺狉狅犿狅狊狅犿犲狋狔狆犲犪犫犲狉狉犪狋犻狅狀染色体结构损伤，表现为在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组的改变。３．３核内复制 犲狀犱狅狉犲犱狌狆犾犻犮犪狋犻狅狀在ＤＮＡ复制的Ｓ期之后，细胞核未进行有丝分裂就开始了另一个Ｓ期的过程。其结果是染色体有４，８，１６……倍的染色质。３．４裂隙 犵犪狆染色体或染色单体损伤的长度小于一个染色单体的宽度，为染色单体的最小的错误排列。３．５染色体数目畸变 犮犺狉狅犿狅狊狅犿犪犾狀狌犿犲狉犻犮犪犾犪犫犲狉狉犪狋犻狅狀染色体数目发生改变，不同于正常核型。３．６多倍体 狆狅犾狔狆犾狅犻犱狔哺乳动物染色体数目正常是二倍体，在化学诱变剂的作用下，染色体数目成倍地增加成三倍体、四倍体等。１犛犖／犜２１７７—２００８３．７染色体结构的畸变 犮犺狉狅犿狅狊狅犿犪犾狊狋狉狌犮狋狌狉犲犪犫犲狉狉犪狋犻狅狀通过显微镜可以直接观察到的发生在细胞有丝分裂中期的染色体的结构变化。如染色体中间缺失和断片，染色体互换和内交换等。３．８最高剂量 犺犻犵犺犲狊狋犱狅狊犲产生毒性体征的剂量，更高剂量将引发试验动物死亡。４ 试剂和仪器４．１ 试剂———０．１％秋水仙碱；———０．９％氯化钠溶液；———０．０７５ｍｏｌ／Ｌ氯化钾溶液；———固定液：甲醇与冰乙酸以３∶１混合，临用时现配；———姬姆萨（Ｇｉｅｍｓａ）染液、姬姆萨应用液，配制方法见《消毒技术规范》；———磷酸盐缓冲液（ｐＨ７．４），配制方法见《消毒技术规范》。４．２ 仪器和器材实验室常用设备、生物显微镜、恒温水浴箱３７℃±５℃、离心机、解剖剪、镊子、注射器、灌胃针头、离心管、吸管、滴管、试管架、载玻片、塑料吸瓶、干净纱布、滤纸等。５ 试验方法５．１ 试验动物成年小鼠（体重２５ｇ～３０ｇ），或大鼠（体重１８０ｇ～２２０ｇ）。每个剂量组每个性别动物不少于５只。试验动物饲养条件应符合ＧＢ１４９２４．１和ＧＢ１４９２５有关规定。５．２ 剂量分组应进行预试验以选择最高剂量，为避免出现假阴性结果应适当增大剂量范围。如果受试样品具有毒性，应在第一个采样时间点设三个剂量，设置的剂量应包括从最大毒性至最小毒性或无毒性的范围。第二次采样时间点仅需设置最高剂量。按等比级数２向下设置中、低剂量组。５．３ 限度试验如果单次染毒剂量不小于２０００ｍｇ／ｋｇ体重，未出现毒性效应，且根据资料预期受试物无遗传毒性，则不需要进行其他染毒剂量的试验。５．４ 样品处理通常用蒸馏水、等渗盐水、植物油、食用淀粉、羧甲基纤维素钠等。如使用特殊溶剂或载体，应有参考资料说明其成分。５．５ 试验步骤５．５．１ 染毒５．５．１．１ 采用灌胃法，也可腹腔注射。一般情况下染毒一次，或者为便于大容量给药，也可分散剂量染毒，即同一日染毒两次，其间隔时间不超过几小时。５．５．１．２ 高剂量组动物分为Ａ、Ｂ两个亚组，分两次采集样品，啮齿类动物采样时间一般为１．５个正常的细胞周期，即Ａ组于末次染毒后１２ｈ～１８ｈ采集样品；Ｂ组于末次染毒后３６ｈ～４２ｈ采集样品；中、低剂量组均于末次染毒后１２ｈ～１８ｈ采集样品。如果采用多次染毒方式，只需在最后一次染毒后１２ｈ～１８ｈ采一次样。２犛犖／犜２１７７—２００８５．５．２ 处死动物于处死动物采集样品前３ｈ～５ｈ腹腔注射秋水仙碱（４ｍｇ／ｋｇ体重），用颈椎脱臼法处死动物，迅速取出股骨，剔去肌肉，擦净血污，剪去两端的骨骺，用带针头的５ｍＬ注射器吸取５ｍＬ生理盐水，插入骨髓腔内，将骨髓冲洗入１０ｍＬ离心管，然后用吸管吹打骨髓团块使其均匀，以１０００ｒ／ｍｉｎ速度离心１０ｍｉｎ，用滴管吸去上清液。５．５．３ 低渗加入０．０７５ｍｏｌ／Ｌ氯化钾溶液９ｍＬ，用滴管将细胞轻轻地混匀，放入３７℃水浴中低渗２０ｍｉｎ。５．５．４ 预固定立即加入固定液（甲醇∶冰乙酸＝３∶１）１ｍＬ，混匀，以１０００ｒ／ｍｉｎ速度离心１０ｍｉｎ，用滴管吸去上清液。５．５．５ 固定加入７ｍＬ固定液，混匀，固定１０ｍｉｎ，以１０００ｒ／ｍｉｎ速度离心１０ｍｉｎ，用滴管吸去上清液。用同法再固定２次。加入０．１ｍＬ～０．５ｍＬ新鲜固定液，用细口滴管充分混匀。５．５．６ 制片在洁净的冷冻玻片上方３ｃｍ～５ｃｍ处滴３滴～４滴细胞悬液于玻片上，轻吹细胞悬液扩散平铺于玻片上，将玻片在酒精灯上微热烘烤，空气中自然干燥。每个标本制片２张～３张。５．５．７ 染色将制备好的标本片放入Ｇｉｅｍｓａ应用液中染色１５ｍｉｎ（根据室温，冬天长些，夏天短些），用蒸馏水冲洗、晾干。５．５．８ 结果分析每个动物至少观察１０００个细胞来确定有丝分裂指数。每只动物镜下至少要分析１００个细胞。５．５．９ 观察项目染色体数目的改变：非整倍体（亚二倍体或超二倍体），多倍体，内复制。染色体结构的改变：断裂、微小体、有着丝点环、无着丝点环、单体互换、双微小体、裂隙和非特定性型变化（如粉碎化、着丝点细长化、粘着等）。６ 试验结果６．１ 数据处理每一只试验动物作为一个观察单位，每组动物按性别分别计算染色体结构畸变细胞百分率。若雌、雄动物之间无明显的性别感受差异时可合并计算结果。６．２ 阳性结果判定方法———有多个决定阳性结果的标准，如受试样品可引起剂量依赖的染色体畸变细胞数目或复制增加。统计学方法可帮助计算结果，但统计学差异不应作为唯一的阳性结果判定因素。———多倍体细胞数目的增加提示受试物可能抑制有丝分裂而导致染色体数目异常。核内复制染色体细胞数目的增加说明受试物可能抑制细胞周期。７ 结果评价阳性结果表明受试样品具有引起受试动物骨髓细胞染色体畸变的能力。阴性结果表明在本试验条件下受试样品不引起受试动物骨髓细胞染色体畸变。犛犖／犜２１７７—２００８