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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２１７８—２００８危险品哺乳动物红细胞微核试验方法犜犲狊狋犿犲狋犺狅犱狅犳犻狀狏犻狏狅犿犪犿犿犪犾犻犪狀犲狉狔狋犺狉狅犮狔狋犲犿犻犮狉狅狀狌犮犾犲狌狊犳狅狉犱犪狀犵犲狉狅狌狊犵狅狅犱狊２００８０９０４发布２００９０３１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准修改采用联合国经济合作与发展组织（ＯＥＣＤ）化学品测试方法Ｎｏ．４７４《哺乳动物红细胞微核试验》（１９９７）。本标准与ＯＥＣＤ化学品测试方法Ｎｏ．４７４相比，存在以下差异：———对ＯＥＣＤ化学品测试方法Ｎｏ．４７４进行了编辑性修改；———增加了前言部分；———增加了试剂和仪器内容。本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。本标准由国家认证认可监督管理委员会归口。本标准负责起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准参加起草单位：中化化工标准化研究所。本标准主要起草人：张园、赵好力宝、于智睿、赵琢、熊中强、李学洋。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２１７８—２００８危险品哺乳动物红细胞微核试验方法１ 范围本标准规定了哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验的术语和定义、试剂和仪器、试验方法及试验结果。本标准适用于检测危险化学品的致突变作用。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ１４９２４．１ 实验动物 配合饲料通用质量标准ＧＢ１４９２５ 实验动物 环境及设施卫生部《消毒技术规范》３ 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。３．１微核 犿犻犮狉狅狀狌犮犾犲狌狊在细胞的有丝分裂后期，染色体有规律地进入子细胞形成细胞核时，仍然滞留在细胞质中的染色单体或染色体的无着丝点断片，或因纺锤体受损而丢失的整条染色体。它在末期以后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的胞质内而形成，因比主核小，故称为微核。３．２微核率 犿犻犮狉狅狀狌犮犾犲狌狊犮犲犾犾狊狉犪狋犲含有微核的嗜多染红细胞数，以千分率（‰）表示。３．３着丝粒 犮犲狀狋狉狅犿犲狉犿；犽犻狀犲狋狅犮犺狅狉犲细胞分裂中期染色体上纺锤丝附着的区域，借此子代染色体得以有规律地向子代细胞两极移动。３．４正染红细胞 狀狅狉犿狅犮犺狉狅犿犪狋犻犮犲狉狔狋犺狉狅犮狔狋犲；犖犆犈成熟红细胞，因其核糖体已消失，可通过选择性的染色而与未成熟红细胞区别开来。３．５嗜多染红细胞 狆狅犾狔犮犺狉狅犿犪狋犻犮犲狉狔狋犺狉狅犮狔狋犲；犘犆犈未成熟红细胞，是红细胞成熟过程中的一个中间阶段，此时因胞质内仍含有核糖体，可通过选择性的染色而与成熟红细胞区别开来。４ 试剂和仪器４．１ 试剂全部试剂除注明外，均为分析纯，试验用水为蒸馏水。４．１．１ 小牛血清（灭活）：配制方法见《消毒技术规范》。１犛犖／犜２１７８—２００８４．１．２ 姬姆萨（Ｇｉｅｍｓａ）染液、Ｇｉｅｍｓａ应用液：配制方法见《消毒技术规范》。４．１．３ 磷酸盐缓冲液（ｐＨ６．８）：配制方法见《消毒技术规范》。４．１．４ 甲醇４．２ 仪器与器材生物显微镜、恒温水浴箱、解剖剪、镊子、止血钳、注射器、灌胃针头、载玻片、塑料吸瓶、乳钵、干净纱布、滤纸等。５ 试验方法５．１ 试验动物常规选用初成年的健康小鼠和大鼠。选用体重为２５ｇ～３０ｇ的小鼠或体重１５０ｇ～２００ｇ的大鼠５０只，雌雄各半。试验动物饲养条件应符合ＧＢ１４９２４．１和ＧＢ１４９２５有关规定。５．２ 剂量分组———至少设置三个剂量组，每个剂量组１０只动物，雌、雄性各半，同时应设阳性对照和阴性对照；———高剂量组应达到不产生动物死亡的最大毒作用剂量；———一般取受试样品１／５、１／１０、１／２０ＬＤ５０剂量，以求获得微核的剂量反应关系曲线；———阳性对照物可选用环磷酰胺（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、甲磺酸乙脂（ｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｐｈｏｎａｔｅ）、乙基亚硝基脲（ｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、丝裂霉素Ｃ（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎＣ）、三亚乙基密胺（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｍｅｌａｍｉｎｅ）等，如使用特殊溶剂的，应设溶剂对照。５．３ 限度试验如果单次染毒剂量不小于２０００ｍｇ／ｋｇ体重，未出现毒性效应，且根据资料预期受试物无遗传毒性，则不需要进行其他染毒剂量的试验。５．４ 样品处理通常用蒸馏水、生理盐水、植物油、食用淀粉、羧甲基纤维素钠等，溶剂应既不干扰测定物质也不产生毒性。如使用特殊溶剂或载体，应有参考资料说明其成分。５．５ 试验步骤５．５．１ 染毒一般采用灌胃法，也可采用腹腔注射法。５．５．１．１ 单次染毒以适当的间隔采集骨髓样品至少２次，开始不早于染毒后２４ｈ，最后不晚于染毒后４８ｈ。外周血采样以适当的间隔至少２次，开始不早于染毒后３６ｈ，最后不晚于染毒后７２ｈ。如在一个采样时间发现阳性结果，则不需要进一步的采样。５．５．１．２ 多次染毒每天一次染毒，共２次或多次（２４ｈ）染毒，可在末次染毒后１８ｈ～２４ｈ之间采集骨髓１次，对周围血可在末次染毒后３６ｈ～４８ｈ之间采样一次。５．５．２ 处死动物处死动物后，立即从大腿骨或胫骨获得骨髓细胞，从尾静脉或其他适当血管取外周血。５．５．３ 制片将骨髓液滴在载玻片一端的小牛血清液滴里，仔细混匀。然后，按血常规涂片法涂片，长度约２ｃｍ～３ｃｍ。在空气中晾干。５．５．４ 固定将干燥的涂片放入甲醇液中固定５ｍｉｎ。如当日不染色，应固定后保存。５．５．５ 染色将固定过的涂片放入Ｇｉｅｍｓａ应用液中，染色１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ，然后立即用磷酸盐缓冲液冲洗。２犛犖／犜２１７８—２００８５．５．６ 封片待染片完全干燥后或用滤纸及时擦干染片背面的水滴后，再用双层滤纸轻轻按压染片，以吸附染片上残留的水分，再在空气中晃动数次，以促其尽快晾干，然后放入二甲苯中透明５ｍｉｎ，取出滴上适量光学树胶，盖上盖玻片，写好标记。５．５．７ 观察应通过骨髓细胞样本每只动物要计数２００个红细胞，外周血样本每只动物计数１０００个红细胞计算正常红细胞和嗜多染红细胞的比例。每只动物至少计数２０００个嗜红染细胞来计算微核率。若一个嗜多染红细胞中出现两个以上微核，仍按一个有微核细胞计数。６ 试验结果６．１ 数据处理每只动物的数据都应以表格形式列出如下内容：嗜红染细胞数、微核细胞数、嗜红染细胞数在总红细胞数中的比例。６．２ 结果评价如果有剂量依赖的微核细胞数目的增加或某一取样时间的某一剂量水平上微核细胞数显著增加，可视为阳性结果。统计学方法可以帮助计算结果，但是不应作为阳性结果的唯一决定因素。犛犖／犜２１７８—２００８