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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２１５７—２００８进出口动物源性食品中痢菌净残留量的检测方法液相色谱质谱／质谱法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犿犲狇狌犻狀犱狅狓狉犲狊犻犱狌犲犻狀犳狅狅犱狊狋狌犳犳狊狅犳犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犎犘犔犆犕犛／犕犛犿犲狋犺狅犱２００８０９０４发布２００９０３１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准的附录Ａ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张代辉、牟峻、荣会、王国民、韩大川、王明泰。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２１５７—２００８进出口动物源性食品中痢菌净残留量的检测方法液相色谱质谱／质谱法１ 范围本标准规定了进出口动物源性食品中痢菌净残留量的测定 液相色谱质谱／质谱法。本标准适用于猪肉、鸡肝、鸡肾、鱼肉、牛奶、蜂蜜中痢菌净的测定和确证。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和实验方法（ＧＢ／Ｔ６６８２—２００８，ＩＳＯ３６９６：１９８７，ＭＯＤ）３ 方法提要试样中残留的痢菌净用三氯甲烷均质或超声波提取，提取液经浓缩，ＨＬＢ固相萃取小柱净化，用液相色谱质谱／质谱法测定和确证，外标法定量。４ 试剂与材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。４．１ 甲醇：色谱纯。４．２ 三氯甲烷：色谱纯。４．３ 无水硫酸钠：经６５０℃灼烧４ｈ，贮于密封容器中备用。４．４ 甲醇水（１＋１，体积比）。４．５ 痢菌净标准物质（Ｍｅｑｕｉｎｄｏｘ，分子式：Ｃ１１Ｈ１０Ｎ２Ｏ３）：纯度大于等于９７％。４．６ 标准储备液的配制：准确称取适量的标准物质（４．５），用甲醇（４．１）配制成浓度为１０００μｇ／ｍＬ的标准储备液，避光－１８℃保存。４．７ 标准中间工作液的配制：准确移取一定体积的标准储备液（４．６），用甲醇（４．１）稀释成适当浓度的标准中间工作液，避光－１８℃保存。４．８ 基质标准工作液的配制：准确移取一定体积的标准中间工作液（４．７），可根据需要用空白样品提取液稀释成适当浓度的标准工作液，当天配制。４．９ 固相萃取小柱：ＷａｔｅｒｓｏａｓｉｓＨＬＢ固相萃取小柱，５００ｍｇ，６ｍＬ，或相当者。４．１０ 微孔滤膜：有机系，０．２０μｍ。５ 仪器和设备５．１ 液相色谱串联四极杆质谱仪：配有电喷雾离子源（ＥＳＩ）。５．２ 固相萃取装置。５．３ 组织捣碎机。５．４ 均质器。１犛犖／犜２１５７—２００８５．５ 超声波发生器。５．６ 旋转蒸发器。５．７ 分析天平：感量为０．００１ｇ。５．８ 高速离心机：４０００ｒ／ｍｉｎ。５．９ 漩涡混合器。５．１０ 聚四氟乙烯离心管：５０ｍＬ，具塞。５．１１ 浓缩瓶：５０ｍＬ、２５０ｍＬ。６ 试样制备与保存６．１ 试样制备６．１．１ 猪肉、鸡肝、鸡肾、鱼肉样品类从所取全部样品中取出有代表性样品约１ｋｇ，将其切成碎块后，依次用组织捣碎机将样品加工成馅状或浆状。混匀，均分成两份作为试样，分装入洁净的盛样袋内，密闭，标明标记。６．１．２ 牛奶类取乳及乳制品样品２００ｇ，将其混合或搅拌均匀，均分成两份作为试样，分装入洁净的盛样袋内，密闭，标明标记。６．１．３ 蜂蜜类取代表性蜂蜜样品２００ｇ，对无结晶的蜂蜜样品将其搅拌均匀，均分成两份作为试样，分装入洁净的盛样袋内，密闭，标明标记；对有结晶析出的蜂蜜样品，在密闭情况下，将样品瓶置于不超过６０℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温，均分成两份作为试样，分装入洁净的盛样袋内，密闭，标明标记。在融化时应注意防止水分挥发。６．２ 试样保存肌肉组织及器脏组织类、水产品类试样于－１８℃以下冷冻保存；乳及乳制品类和蜂蜜类试样于０℃～４℃保存。在抽样及制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。７ 测定步骤７．１ 提取７．１．１ 猪肉、鸡肝、鸡肾、鱼肉样品称取５ｇ样品（精确至０．０１ｇ）于５０ｍＬ具塞离心管中，加入５ｇ硫酸钠（４．３）与样品充分混匀，再加入２０ｍＬ三氯甲烷（４．２），高速均质提取３ｍｉｎ，于４０００ｒ／ｍｉｎ条件下离心３ｍｉｎ，将上层提取液移入２５０ｍＬ浓缩瓶中，残渣用２×２０ｍＬ三氯甲烷重复提取两次，合并提取液。将所得提取液于４０℃水浴减压浓缩至近干，残渣加入５ｍＬ甲醇水溶液（４．４）溶解。７．１．２ 蜂蜜、牛奶样品称取５ｇ样品（精确至０．０１ｇ）于５０ｍＬ具塞离心管中，加入１０ｍＬ水，超声波提取１０ｍｉｎ，加入２０ｍＬ三氯甲烷，振荡提取５ｍｉｎ，于４０００ｒ／ｍｉｎ条件下离心３ｍｉｎ，将下层提取液移入浓缩瓶中。再加入２０ｍＬ三氯甲烷，重复上述操作两次，合并提取液。将所得提取液于４０℃水浴减压浓缩至近干，残渣加入５ｍＬ甲醇水溶液溶解。７．２ 净化分别用５ｍＬ甲醇，５ｍＬ甲醇水预处理ＨＬＢ固相萃取小柱（４．９），保持柱体湿润，将上述提取液转移至上述柱中，弃去流出液，用１０ｍＬ甲醇洗脱，以小于１ｍＬ／ｍｉｎ速度收集全部洗脱液于５０ｍＬ浓缩瓶中，于４０℃水浴中旋转浓缩至近干。用甲醇溶解并定容至１．０ｍＬ，经０．２μｍ滤膜过滤后，供液相色谱质谱／质谱定量测定和确证。２犛犖／犜２１５７—２００８７．３ 测定７．３．１ 液相色谱条件ａ） 色谱柱：ＺＯＲＢＡＸＳＢＣ１８，１５０ｍｍ×２．１ｍｍ，３．５μｍ，或相当者；ｂ） 流动相：甲醇水（７０＋３０）；ｃ） 流速：０．２ｍＬ／ｍｉｎ；ｄ） 柱温：２０℃；ｅ） 进样量：１０μＬ。７．３．２ 质谱条件ａ） 离子源：电喷雾离子源；ｂ） 扫描方式：正离子扫描；ｃ） 检测方式：多反应监测（ＭＲＭ）；ｄ） 电喷雾电压（ＩＳ）：５５００Ｖ；ｅ） 雾化气压力（ＧＳ１）：３０Ｐａ；ｆ） 气帘气压力（ＣＵＲ）：２５Ｐａ；ｇ） 辅助气压力（ＧＳ２）：２０Ｐａ；ｈ） 离子源温度（ＴＥＭ）：５５０℃；ｉ） 定性离子对、定量离子对、去簇电压（ＤＰ）、碰撞气能量（ＣＥ）及碰撞室出口电压（ＣＸＰ）见表１。表１ 痢菌净定性离子对、定量离子对、去簇电压、碰撞气能量和碰撞室出口电压名称定性离子对ｍ／ｚ定量离子对ｍ／ｚ去簇电压（ＤＰ）／Ｖ碰撞气能量（ＣＥ）／Ｖ碰撞室出口电压（ＣＸＰ）／Ｖ痢菌净２１９．２／１４３．２２１９．２／１５９．９２１９．２／１８５．０２１９．２／１４３．２７０２９２０２６１０７．３．３ 定量测定根据样液中被测痢菌净药物含量，选定浓度相近的基质标准工作液。基质标准工作液和待测样液中痢菌净药物的响应值均应在仪器检测的线性范围内。对标准溶液与样液等体积分组分时段参插进样测定。外标法定量。在上述液相色谱质谱／质谱条件下，痢菌净标准物质的保留时间约为２．３ｍｉｎ，标准溶液的选择性离子流图参见附录Ａ中图Ａ．１。７．３．４ 定性测定对基质标准工作液及样液按上述规定的条件进行测定时，如果样液与基质标准工作液的选择离子图中，在相同保留时间有峰出现，所有选择离子均应出现。则根据定性选择离子对的种类及其相对丰度比对其进行阳性确证。定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差见表２。表２ 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度／％＞５０＞２０～５０＞１０～２０≤１０允许的最大偏差／％±２０±２５±３０±５０７．４ 空白试验除不加试样外，按上述相同条件和步骤进行。８ 结果计算和表述用色谱数据处理机或按式（１）计算试样中痢菌净残留含量，计算结果需扣除空白值。犡＝犃×犮×犞犃ｓ×犿…………………………（１）３犛犖／犜２１５７—２００８ 式中：犡———试样中痢菌净残留量，单位为毫克每千克（ｍｇ／ｋｇ）；犃———样液中痢菌净的峰面积；犮———基质标准工作液中痢菌净的浓度，单位为微克每毫升（μｇ／ｍＬ）；犞———样液最终定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；犃ｓ———基质标准工作液中痢菌净的峰面积；犿———最终样液代表的试样质量，单位为克（ｇ）。９ 测定低限和回收率９．１ 测定低限（犔犗犙）本方法的测定低限为０．０１０ｍｇ／ｋｇ。９．２ 回收率在０．０１０ｍｇ／ｋｇ～０．０４０ｍｇ／ｋｇ添加浓度范围内，回收率的实验数据见表３。表３ 不同添加浓度回收率数据添加浓度／（ｍｇ／ｋｇ）回收率／％鱼肉猪肉鸡肾鸡肝蜂蜜牛奶０．０１０８０．２～９６．４７５．０～９２．１７２．３～９３．０７１．６～８３．５８８．６～９８．２８２．９～９６．８０．０２０７５．６～９４．３８０．２～９８．８７７．３～９５．７７２．７～８５．２８１．６～９６．９８０．９～９７．００．０４０７８．３～９８．４８２．１～９５．３７３．６～９７．８７１．４～８８．１８７．３～９９．０８２．２～９９．１４犛犖／犜２１５７—２００８附 录 犃（资料性附录）痢菌净标准品选择性离子流图１）图犃．１ 痢菌净标准品的选择性离子流图图犃．２ 痢菌净标准品的母离子全扫描质谱图１） 附录Ａ所得谱图是在ＡＰＩ４０００质谱仪上完成的，此处列出试验用仪器型号仅是为了提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试采用不同厂家或型号的仪器。５犛犖／犜２１５７—２００８图犃．３ 痢菌净标准品的子离子全扫描质谱图６犛犖／犜２１５７—２００８