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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２１４３—２００８进出口食品中隐孢子虫检测方法犘犆犚法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犆狉狔狆狋狅狊狆狅狉犻犱犻狌犿犻狀犳狅狅犱犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犘犆犚犿犲狋犺狅犱２００８０９０４发布２００９０３１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言本标准的附录Ａ为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李晓虹、闫东丽、韩伟。本标准是首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２１４３—２００８进出口食品中隐孢子虫检测方法犘犆犚法１ 范围本标准规定了食品中隐孢子虫的ＰＣＲ检验方法。本标准适用于果汁、牛奶、叶类蔬菜及水果、贝壳类中隐孢子虫的快速检验。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ５７５０．１２ 生活饮用水标准检验方法 微生物指标ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和实验方法（ＧＢ／Ｔ６６８２—２００８，ＩＳＯ３６９６：１９８７）ＳＮ／Ｔ１１９３ 基因检验实验室技术要求３ 定义、术语和缩略语下列术语、定义和缩略语适用于本标准。３．１ 定义和术语３．１．１隐孢子虫 犮狉狔狆狋狅狊狆狅狉犻犱犻狌犿隐孢子虫为顶端复合体门、孢子虫纲、球虫亚纲、真球虫目、艾美球虫亚目、隐孢子虫科、隐孢子虫属。是直径在（３．２μｍ～５．１μｍ）×（８．０μｍ～８．５μｍ）的极微小的，无法以肉眼辨识的单细胞寄生虫。隐孢子虫寄生于人或动物的胃肠道上皮和呼吸道上皮微绒毛，其隐孢子虫病是一种重要的人畜共患寄生虫病。感染多经过食源性或水源性传播途径感染。目前公认的隐孢子虫有效种为１３个种。其中感染人最主要的是微小隐孢子虫（犆．狆犪狉狏狌犿）。３．２ 缩略语３．２．１犐犕犛 犻犿犿狌狀狅犿犪犵狀犲狋犻犮狊犲狆犪狉犪狋犻狅狀免疫磁珠分离。３．２．２犚犉犔犘 犚犲狊狋狉犻犮狋犻狅狀犉狉犪犵犿犲狀狋犔犲狀犵狋犺犘狅犾狔犿狅狉狆犺犻狊犿限制性片段长度多态性分析。４ 设备和材料４．１ 电子天平：感量为０．００１ｇ。４．２ 显微镜：×１００倍。４．３ 离心机：３０００ｒ／ｍｉｎ。４．４ 恒温水浴锅：３６℃±１℃，６５℃±１℃。４．５ ＰＣＲ扩增仪。１犛犖／犜２１４３—２００８４．６ 电泳仪。４．７ 磁极和混匀器。４．８ 微波炉。４．９ 紫外检测仪或凝胶成像系统。４．１０ 微量可调移液器：１０μＬ，１００μＬ，２００μＬ，１０００μＬ。４．１１ ＦＴＡ卡（Ｗｈａｔｍａｎ公司或同类产品）。４．１２ 直径６ｍｍ打孔机（Ｗｈａｔｍａｎ公司或同类产品）。４．１３ 振荡器。４．１４ 摇床。４．１５ 过滤均质袋（４００ｍＬ）（法国犐狀狋犲狉狊犮犻犲狀犮犲，ＳｔＮｏｍ公司或同类产品）。５ 试剂除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。５．１ 抗隐孢子虫磁珠试剂盒（丹麦Ｄｙｎａｌ公司或同类产品）。５．２ ＤＮＡ抽提试剂盒。５．３ ２×犜犪狇ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ［０．１Ｕ犜犪狇Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ／μＬ、５００μｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｅａｃｈ、２０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１００ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ、３ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２、其他稳定剂和增强剂］：北京天为时代公司或同类产品。５．４ １００ｂｐＤＮＡｍａｒｋｅｒ。５．５ １０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ。５．６ ０．１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）。５．７ 琼脂糖。５．８ 溴化乙锭。５．９ 引物：见表１。表１ 隐孢子虫引物序列及扩增片段长度ＰＣＲ扩增引物名称引物序列（５′３′）扩增片段大小／ｂｐＰｒｉｍａｒｙＰＣＲＥｘＣｒｙｌＦａＥｘＣｒｙ２ＲｂＴＴＣＴＡＧＡＧＣＴＡＡＴＡＣＡＴＧＣＧＣＣＣＡＣＴＴＣＴＴＣＧＡＡＧＣＡＧＧＡ１３３０ＮｅｓｔｅｄＰＣＲＮｅｓＣｒｙ３ＦａＮｅｓＣｒｙ４ＲｂＧＧＡＡＧＧＧＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＴＡＧＡＴＡＡＡＧＣＴＣＡＴＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＡ８３０ 注：Ｆａ为Ｆｏｒｗａｒｄ（正向），Ｒｂ为Ｒｅｖｅｒｓｅ（反向）。５．１０ ＦＴＡ纯化试剂：Ｗｈａｔｍａｎ公司或同类产品。５．１１ ＦＴＡ卡洗液ＴＥｂｕｆｆｅｒ：０．０１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．０；０．１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，Ｗｈａｔｍａｎ公司或同类产品。５．１２ １％ＢＳＡ（牛血清白蛋白）。５．１３ ０．１ｍｏｌ／Ｌ盐酸（ＨＣｌ）。５．１４ １ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠（ＮａＯＨ）。５．１５ ＴＡＥ电泳缓冲液（储备液５０×）：Ｔｒｉｓ碱２４２ｇ、冰乙酸５７．１ｍＬ、０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１００ｍＬ，用蒸馏水定容至１０００ｍＬ，混匀，室温保存。使用时取２０ｍＬ５０×ＴＡＥ电泳缓冲液，稀释为１０００ｍＬ工作液即可。５．１６ 犞狊狆Ⅰ限制性内切酶：Ｐｒｏｍｅｇａ公司或同类产品。５．１７ 犛狊狆Ⅰ限制性内切酶：Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司或同类产品。５．１８ 质控标准卵囊：微小隐孢子虫（犆狉狔狆狋狅狊狆狅狉犻犱犻狌犿狆犪狉狏狌犿）ＰＵＳ８３０４、贝氏隐孢子虫（犆狉狔狆狋狅狊狆狅２犛犖／犜２１４３—２００８狉犻犱犻狌犿犫犪犻犾犲狔犻）Ｐ０５３、安氏隐孢子虫（犆狉狔狆狋狅狊狆狅狉犻犱犻狌犿犪狀犱犲狉狊狅狀犻）Ｐ０５２、犬隐孢子虫（犆狉狔狆狋狅狊狆狅狉犻犱犻狌犿犮犪狀犻狊）ＰＵＳ８２９７或适宜的隐孢子虫卵囊。阴性质控菌株为适宜的非隐孢子虫卵囊。６ 检验步骤６．１ 方法提要食品经处理后，用ＩＭＳ方法分离纯化隐孢子虫卵囊，再用ＦＴＡ卡提取ＤＮＡ，以提取的ＤＮＡ为模板进行巢式ＰＣＲ扩增，琼脂糖凝胶电泳检验ＰＣＲ产物是否有特征条带，从而对食品中隐孢子虫进行快速检验。如有必要，可鉴定到种。６．２ 检验程序隐孢子虫ＰＣＲ检验程序见图１。图１ 隐孢子虫犘犆犚检验程序６．３ 检测步骤６．３．１ 食品样品处理６．３．１．１ 对于饮料类样品直接以无菌操作取样品１０ｍＬ进行下一步的ＩＭＳ操作。６．３．１．２ 对于叶类或贝壳类样品称取２５ｇ放入过滤均质袋中，加入１００ｍＬ双蒸水，密封后放至摇床上轻轻振荡３０ｍｉｎ，将滤液倾倒入２个５０ｍＬ离心管中，２０００犵离心２０ｍｉｎ；去上清液，用双蒸水重悬２个５０ｍＬ离心管中沉淀物及部分上清液，将重悬物转移至另一５０ｍＬ离心管，总体积不得超过１０ｍＬ，然后进行下一步的ＩＭＳ操作。６．３．２ 隐孢子虫卵囊的分离与纯化将处理好的样品１０ｍＬ，用抗隐孢子虫磁珠试剂盒分离纯化隐孢子虫卵囊，其操作参照说明书，最后得到的卵囊悬液进行下一步的ＤＮＡ抽提。保存剩余分离纯化好的隐孢子虫卵囊，以备确证试验使用。３犛犖／犜２１４３—２００８６．３．３ 模板犇犖犃提取将上述分离纯化好的隐孢子虫卵囊约１０μＬ滴加到ＦＴＡ卡上，按ＦＴＡ卡操作说明书提取模板ＤＮＡ。所提取的模板ＤＮＡ，可常温下储存，也可直接放入ＰＣＲ管中进行后续反应。６．３．４ 巢式犘犆犚扩增（可参照相关试剂盒操作说明）６．３．４．１ 初始ＰＣＲ（ＰｒｉｍａｒｙＰＣＲ）：反应体系为ＤＮＡ模板（６．３．３中制得的ＦＴＡ滤膜片一片），２×犜犪狇ＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ５０μＬ；１％ＢＳＡ４μＬ；１０μｍｏｌ／Ｌ引物各２．５μＬ；双蒸水４１μＬ。反应条件：９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，５４℃退火４５ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃延伸８ｍｉｎ。扩增产物长度为１３３０ｂｐ。６．３．４．２ 巢式ＰＣＲ（ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ）：反应体系为ＤＮＡ模板（第一轮ＰＣＲ产物）１μＬ，２×ＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ５０μＬ；１０μｍｏｌ／Ｌ引物各５μＬ；双蒸水３９μＬ；反应条件：９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ，５８℃退火４５ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃延伸８ｍｉｎ。扩增产物长度为８３０ｂｐ。６．３．５ 质量控制检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照为５．１８中所列的隐孢子虫卵囊或适宜的质控隐孢子虫卵囊，阴性对照为非隐孢子虫卵囊，空白对照加入无菌水作为对照。６．３．６ 巢式犘犆犚扩增产物电泳检验用１×ＴＡＥ电泳缓冲液配制２％琼脂糖电泳凝胶（溴化乙锭终浓度达到１．０μｇ／ｍＬ），制胶。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面没过胶面。将１０μＬ第二轮ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ扩增产物点样，同时加入１００ｂｐＤＮＡＭａｒｋｅｒ。９Ｖ／ｃｍ恒压，电泳２０ｍｉｎ～３０ｍｉｎ。紫外凝胶成像仪下观察电泳结果，拍照并记录结果。６．４ 结果及判断６．４．１ 犘犆犚扩增产物电泳检验结果隐孢子虫ＰＣＲ扩增产物为８３０ｂｐ。６．４．２ 结果判断阴性对照和空白对照均未出现特征条带；阳性对照出现预期大小的特征条带；待测样品出现预期大小的特征条带，怀疑存在隐孢子虫，需进一步确证；待测样品未出现预期大小的扩增条带，为阴性结果。６．４．３ 确证试验将６．４．２中出现特征性条带对应的卵囊，参照ＧＢ／Ｔ５７５０．１２方法进行镜检鉴定。６．４．４ 结果表述ＰＣＲ扩增产物电泳检验结果阳性，且经确证为阳性，报告检出隐孢子虫。ＰＣＲ扩增产物电泳检验结果阴性，报告未检出隐孢子虫。６．５ 微小隐孢子虫种鉴定６．５．１ 犚犉犔犘分析６．４．４中确证为阳性的ＰＣＲ产物用犞狊狆Ⅰ、犛狊狆Ⅰ限制性内切酶进行酶切。犞狊狆Ⅰ限制性内切酶的反应体系为：ｄｄＨ２Ｏ２．３μＬ，１０×ｂｕｆｆｅｒ２μＬ，ＢＳＡ０．２μＬ，犞狊狆Ⅰ酶０．５μＬ，第二轮巢式ＰＣＲ产物１５μＬ，３７℃反应２ｈ。犛狊狆Ⅰ限制性内切酶的反应体系为：ｄｄＨ２Ｏ７μＬ，１０×ｂｕｆｆｅｒ２μＬ，犛狊狆Ⅰ酶１μＬ，第二轮巢式ＰＣＲ产物１０μＬ，３７℃反应２ｈ。６．５．２ 犞狊狆Ⅰ、犛狊狆Ⅰ限制性内切酶酶切反应产物电泳检验操作步骤同６．３．６。６．５．３ 结果表述经犞狊狆Ⅰ酶酶切产物电泳分别得到１０２ｂｐ、６２８ｂｐ片断结果的，报告检出微小隐孢子虫。４犛犖／犜２１４３—２００８经犛狊狆Ⅰ酶酶切产物电泳分别得到１１１ｂｐ、２５４ｂｐ、４４９ｂｐ片断结果的，报告检出微小隐孢子虫。经犞狊狆Ⅰ酶或犛狊狆Ⅰ酶酶切产物电泳未得到１０２ｂｐ、６２８ｂｐ或１１１ｂｐ、２５４ｂｐ、４４９ｂｐ片断结果的，报告未检出微小隐孢子虫。６．６ 废弃物处理和防止污染的措施检验过程中防止交叉污染的措施按照附录Ａ的规定执行。５犛犖／犜２１４３—２００８附 录 犃（规范性附录）检测过程中防止交叉污染的措施犃．１ 抽样和制样过程抽样和制样工具，应清洗干净，１２１℃高压灭菌１５ｍｉｎ～２０ｍｉｎ，一套洁净工具限于一份样品使用。存放样品的容器应该经过清洗、高压，或为一次性灭菌容器。犃．２ 检测过程犃．２．１ ＰＣＲ实验室应分为样品制备区、前ＰＣＲ区、ＰＣＲ区和后ＰＣＲ区。将模板提取、ＰＣＲ反应液配制、ＰＣＲ循环扩增及ＰＣＲ产物的鉴定等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从“净区”到“脏区”单向进行。犃．２．２ 实验过程中，应穿戴实验服和手套，手套要经常更换。各区要有专用实验服，经常清洗。犃．２．３ 各区所有的试剂、器材（尤其是移液器）、仪器都应专用，不得带出该区。犃．２．４ 所有溶液、水、耗材和器具要１２１℃，１５ｍｉｎ高压，避免核酸和（或）核酸酶污染。每种溶液应使用高质量的成分和新蒸馏的双蒸水。在２０℃～２５℃贮存的试剂中，可加入０．０２５％的叠氮钠。所有试剂应该以大体积配制，然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。犃．２．５ ＤＮＡ模板或引物的离心管打开之前，要短暂离心，离心管不能用力崩开，以免产生气溶胶。犃．２．６ 前ＰＣＲ区中，最好能在ＰＣＲ操作箱中加入ＰＣＲ反应各组分。犃．２．７ 实验前后，实验室用紫外线消毒以破坏残留的ＤＮＡ。犃．２．８ 可使用ＵＤＧ和ｄＵＴＰ系统控制污染。犃．２．９ 应遵循ＰＣＲ操作的其他要求。６犛犖／犜２１４３—２００８