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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２１２１—２００８流行性造血器官坏死病检疫技术规范犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲犳狅狉犲狆犻狕狅狅狋犻犮犺犪犲犿犪狋狅狆狅犻犲狋犻犮狀犲犮狉狅狊犻狊２００８０９０４发布２００９０３１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言本标准修改采用了国际兽疫局（ＯＩＥ）《水生动物疾病诊断手册》（２００６版）的第２．１．１章。本标准与《水生动物疾病诊断手册》（２００６版）的第２．１．１章相比，主要差异如下：———对样品处理以及试验条件进行了调整和优化，如核酸抽提采用ＣＴＡＢ酚三氯甲烷方法；———重新编排了格式。本标准的附录Ｂ为规范性附录，附录Ａ、附录Ｃ、附录Ｄ、附录Ｅ均为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国广州出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘荭、乌日琴、江育林、叶奕优、何俊强、史秀杰、高隆英。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２１２１—２００８流行性造血器官坏死病检疫技术规范１ 范围本标准规定了流行性造血器官坏死病病原分离、酶联免疫吸附试验和聚合酶链式反应检测方法。本标准适用于流行性造血器官坏死病的检疫。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法（ＧＢ／Ｔ６６８２—２００８，ＩＳＯ３６９６：１９８７，ＭＯＤ）ＧＢ／Ｔ１８０８８—２０００ 出入境动物检疫采样３ 概述流行性造血器官坏死病（Ｅｐｉｚｏｏｔｉｃｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｎｅｃｒｏｓｉｓ，ＥＨＮ）是由流行性造血器官坏死病毒（Ｅｐｉｚｏｏｔｉｃｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｎｅｃｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ，ＥＨＮＶ）引起的有鳍鱼类一种疾病（参见附录Ａ）。４ 试剂和材料４．１ 水：符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。４．２ ＥＨＮＶ参考株：由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供。４．３ 细胞系：ＢＦ２（铜吻鳞鳃太阳鱼成纤维细胞系）、ＦＨＭ（一种鲤科鱼类的细胞系），ＥＰＣ（鲤鱼上皮瘤细胞系），ＣＨＳＥ（大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系）。用１９９培养液（见附录Ｂ第Ｂ．２章）培养。４．４ ４羟乙基哌嗪乙磺酸（ＨＥＰＥＳ）。４．５ 抗体：由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供。４．６ 犜犪狇酶：－２０℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。４．７ ｄＮＴＰｓ：含ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ各１０ｍｍｏＬ／Ｌ。４．８ 引物：浓度为４０μｍｏＬ／Ｌ。其序列如下： Ｍ１５１：５’ＡＡＣＣＣＧＧＣＴＴＴＣＧＧＧＣＡＧＣＡ３’ Ｍ１５２：５’ＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴＧＡＴＧＡＧＡＴ３’ 扩增主要衣壳蛋白基因中３２１ｂｐ的片段。 Ｍ１５３：５’ＡＴＧＡＣＣＧＴＣＧＣＣＣＴＣＡＴＣＡＣ３’ Ｍ１５４：５’ＣＣＡＴＣＧＡＧＣＣＧＴＴＣＡＴＧＡＴＣ３’扩增主要衣壳蛋白基因中６２５ｂｐ的片段。４．９ 异丙醇：分析纯，使用前预冷到－２０℃。４．１０ 矿物油：要求无ＤＮＡ酶和ＲＮＡ酶，用于无热盖的ＰＣＲ扩增仪。４．１１ ＴｒｉｔｏｎＸ１００：２％（体积分数）。５ 器材和设备５．１ ９６孔细胞培养板、不同规格的细胞培养瓶。１犛犖／犜２１２１—２００８５．２ 倒置显微镜。５．３ 恒温培养箱。５．４ 普通冰箱和超低温冰箱。５．５ 组织研磨器。５．６ 离心机和离心管。５．７ ＰＣＲ扩增仪。５．８ 水平电泳仪。５．９ 不同规格的微量移液器及吸头。５．１０ 紫外观察灯或凝胶成像仪。５．１１ 制冰机。５．１２ 高压灭菌器。６ 犈犎犖犞的分离６．１ 采样有临床症状的鱼，体长小于３ｃｍ的鱼苗取整条鱼后，去头和尾：体长３ｃｍ～６ｃｍ的鱼苗取内脏（包括肾）；体长大于６ｃｍ的鱼则取肝、肾和脾。取样数量按照ＧＢ／Ｔ１８０８８的规定。６．２ 样品处理先用组织研磨器将样品匀浆成糊状。再按１∶１０的最终稀释度重悬于培养液中。如果在匀浆前未用抗菌素处理过样品，则须将样品匀浆后再悬浮于含有１０００ＩＵ／ｍＬ青霉素和１０００μｇ／ｍＬ链霉素的培养液中，于１５℃下孵育２ｈ～４ｈ或４℃下孵育６ｈ～２４ｈ。７０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，收集上清液。６．３ 病毒分离细胞传代使用胰酶ＥＤＴＡ消化液（见附录Ｂ第Ｂ．１章）。对１∶１０的组织匀浆上清液再作两次１０倍稀释，然后将１∶１０、１∶１００、１∶１０００３个稀释度的上清液分别接种到生长２４ｈ以内的９６孔板里的细胞单层中，每孔的细胞单层最多接种１００μＬ稀释液。１５℃～２０℃吸附０．５ｈ～１ｈ后，加入细胞培养液（见附录Ｂ第Ｂ．２章）。置于２２℃培养。试验设２个阳性对照（接种ＥＨＮＶ标准株）和２个空白对照（未接种病毒的细胞）。阳性对照和待测样品都接种细胞后，７ｄ内每天用倒置显微镜检查。空白对照细胞应当正常。如果接种了被检匀浆上清稀释液的细胞培养中出现细胞病变（ＣＰＥ），应立即进行鉴定。ＣＰＥ表现为局部区域细胞开始裂解，周围细胞收缩变圆，逐渐发展，细胞最终全部脱落。如果除阳性对照细胞外，没有ＣＰＥ出现，则在培养７ｄ后还要用敏感细胞进行盲传。传代时，将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻融一次，以７０００ｒ／ｍｉｎ、４℃离心１５ｍｉｎ，收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，培养７ｄ，每天镜检。如果阳性对照也未出现ＣＰＥ，则必须换用敏感细胞和一批新的组织样品重新进行另一系列的病毒学检查。６．４ 犈犎犖犞的犘犆犚检测６．４．１ 样品处理将４５０μＬ细胞病变悬液或组织悬液，放入１．５ｍＬ的离心管，再加入４５０μＬＣＴＡＢ溶液（见附录Ｂ第Ｂ．３章）并混匀，２５℃作用２．５ｈ。６．４．２ 病毒犇犖犃抽提在含有样品的塑料离心管中加入６００μＬ抽提液１（见附录Ｂ第Ｂ．４章），用力混合至少３０ｓ。１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，小心取上层水相（约８００μＬ）。加入７００μＬ抽提液２（见附录Ｂ第Ｂ．５章），用力混合至少３０ｓ。１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，小心取上层水相（约６００μＬ）。加入－２０℃预冷的１．５倍体积的无水乙醇（约９００μＬ），倒置数次混匀后，－２０℃８ｈ以上沉淀核酸。１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，２犛犖／犜２１２１—２００８小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体。３７℃干燥２０ｍｉｎ；最后加１１μＬ～１２μＬ水溶解后，作为ＰＣＲ模板。６．４．３ 目的犇犖犃片段扩增反应体系为１００μＬ：在０．５ｍＬ反应管中加入ｄＮＴＰ２μＬ，Ｍ１５１和Ｍ１５２或者Ｍ１５３和Ｍ１５４各２．５μＬ，２５ｍｍｏＬ／Ｌ的氯化镁（ＭｇＣｌ２）（见附录Ｂ第Ｂ．６章）１０μＬ、１０倍犜犪狇酶１０倍浓缩缓冲液（见附录Ｂ第Ｂ．７章）１０μＬ、犜犪狇酶１μＬ、模板１０μＬ，加水到总体积１００μＬ。如使用无热盖的ＰＣＲ扩增仪，需在反应混合物上覆加５０μＬ矿物油。混匀后低速离心，让矿物油在上层。再将反应管置于ＰＣＲ扩增仪。９４℃变性４ｍｉｎ；９４℃变性１ｍｉｎ、５０℃退火１ｍｉｎ、７２℃延伸１ｍｉｎ，３５次循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。６．４．４ 设立对照在６．４．１中的样品处理过程中必须设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照。６．４．４．１ 取含有已知ＥＨＮＶ的病毒标准株的细胞悬液作为阳性对照。６．４．４．２ 取正常的鱼组织抽提核酸作为阴性对照。６．４．４．３ 取等体积的水代替模板作为空白对照。６．４．５ 琼脂糖电泳用ＴＢＥ（见附录Ｂ第Ｂ．８章）电泳缓冲液配制１．５％的琼脂糖（含１μｇ／ｍＬＥＢ，见附录Ｂ第Ｂ．９章）平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将６μＬＰＣＲ扩增产物和上样缓冲液（见附录Ｂ第Ｂ．１０章）按比例混匀后加入样品孔。在电泳时使用核酸分子量标准参照物作对照。５Ｖ／ｃｍ电泳约０．５ｈ，当溴酚蓝到达底部时停止。６．４．６ 结果判定在紫外观察灯上或用凝胶成像仪观察扩增带并判断结果。ＰＣＲ后阳性对照会分别出现３２１ｂｐ和６２５ｂｐ的ＤＮＡ片段，阴性对照和空白对照没有该扩增带。待测样品电泳后，引物Ｍ１５１和Ｍ１５２的扩增产物（参见附录Ｃ）在３２１ｂｐ的位置上有带，引物Ｍ１５３和Ｍ１５４的扩增产物（参见附录Ｄ）在６２５ｂｐＤＮＡ位置上都有带者，取ＰＣＲ扩增产物测序或进行酶切反应，同参考序列或酶切反应结果（参见附录Ｅ）进行比较，符合的可判断待测样品结果为阳性。无扩增带或扩增带的大小不是３２１ｂｐ和６２５ｂｐ的为阴性。６．５ 犈犎犖犞的抗原捕获犈犔犐犛犃检测６．５．１ 样品处理同病毒分离。６．５．２ 微量板包被和封闭将一抗（兔抗或者鼠抗ＥＨＮＶ抗体）用ｐＨ９．６的包被缓冲液（见附录Ｂ第Ｂ．１１章）作适当稀释后包被ＥＬＩＳＡ微量反应板，每孔１００μＬ。４℃孵育过夜。用ＰＢＳＴ（见附录Ｂ第Ｂ．１２章）洗４次。用封闭液（见附录Ｂ第Ｂ．１３章）于２５℃下封闭３０ｍｉｎ。用ＰＢＳＴ洗４次。６．５．３ 病原检测在孔内分别加入１００μＬ含有待测病毒的细胞培养液或组织悬液，另将阳性对照、正常组织样品（阴性对照）和细胞培养液（空白对照）也各加２孔。２５℃下反应９０ｍｉｎ。用ＰＢＳＴ洗４次。各孔加一定稀释度的第二抗体（抗ＥＨＮＶ的抗血清），２５℃下反应９０ｍｉｎ。用ＰＢＳＴ洗４次。每孔加０．１ｍＬ０．１％的Ｈ２Ｏ２（用双蒸水稀释）。３７℃反应１５ｍｉｎ以除掉非特异性的过氧化物酶。倒出孔内液体。用ＰＢＳＴ洗４次。每孔加１００μＬ用辣根过氧化物酶标记了的抗体，２５℃下反应９０ｍｉｎ。用ＰＢＳＴ洗４次。６．５．４ 结果判读加底物ＯＰＤ溶液（见附录Ｂ第Ｂ．１４章），当阳性对照出现明显棕黄色，阴性对照无色时，立即每孔３犛犖／犜２１２１—２００８加入０．２ｍＬ浓度为２ｍｏｌ／Ｌ硫酸终止反应。加入终止液后１０ｍｉｎ内用酶标仪测量各孔在４９０ｎｍ波长时的光吸收值（Ａ４９０值）。以空白对照的Ａ４９０值为零点。先计算阳性对照和阴性对照的Ａ４９０值之比。阳性对照孔的Ａ４９０值（Ｐ）与阴性对照孔的Ａ４９０值（Ｎ）之比大于２．１（即Ｐ／Ｎ≥２．１），表明对照成立。再计算待测样品孔和阴性对照孔的Ａ４９０值之比。当样品孔的Ａ４９０值（Ｐ）与阴性对照孔的Ａ４９０值（Ｎ）之比大于或等于２．１（即Ｐ／Ｎ≥２．１）时定为阳性。７ 综合判断———确诊为犈犎犖犞阳性的标准满足下列两条标准中任何一条都可以确诊为ＥＨＮＶ阳性。７．１ 如果鱼有临床症状，并且从病鱼中分离到病毒ＥＨＮＶ并用ＰＣＲ或者ＥＬＩＳＡ鉴定为ＥＨＮＶ；或者用ＥＬＩＳＡ检测病鱼的组织中有ＥＨＮＶ抗原。７．２ 如果鱼没有临床症状，从样品中分离到病毒并用ＰＣＲ或者ＥＬＩＳＡ鉴定为ＥＨＮＶ，则确认检测结果也是阳性。４犛犖／犜２１２１—２００８附 录 犃（资料性附录）流行性造血器官坏死病 流行性造血器官坏死（ＥＨＮ）是引起红鳍鲈犘犲狉犮犪犳犾狌狏犻犪狋犻犾犻狊，虹鳟犗狀犮狅狉犺狔狀犮犺狌狊犿狔犽犻狊狊、欧鲶犛犻犾狌狉狌狊犵犾犪狀犻狊和鱼犐犮狋犪犾狌狉狌狊犿犲犾犪狊幼鱼和成鱼出现内脏坏死，以至死亡的一种鱼类传染病。ＥＨＮ病原为流行性造血器官坏死病毒（Ｅｐｉｚｏｏｔｉｃｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｎｅｃｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ，ＥＨＮＶ），是虹彩病毒科蛙病毒属的成员，该属代表种为蛙病毒３型，其他病毒有伯勒虹彩病毒（Ｂｏｈｌｅｖｉｒｕｓ，ＢＩＶ）、欧洲鱼病毒（Ｅｕｒｏｐｅａｎｃａｔｆｉｓｈｖｉｒｕｓ，ＥＣＶ）、欧洲六须鲇病毒（Ｅｕｒｏｐｅａｎｓｈｅａｔｆｉｓｈｖｉｒｕｓ，ＥＳＶ）和桑蒂库帕蛙病毒（ＳａｎｔｅｅＣｏｏｐｅｒｒａｎａｖｉｒｕｓ），以及一些暂定病毒。美洲、欧洲和澳洲在健康或者患病的蛙、蝾、爬行动物中都分离出蛙病毒属病毒。蛙病毒粒子大小１５０ｎｍ～１８０ｎｍ，呈二十面体。病毒基因