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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２１０４—２００８进出口化妆品中双香豆素和环香豆素的测定液相色谱法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犱犻犮狌犿犪狉狅犾犪狀犱犮狔犮犾狅犮狅狌犿犪狉狅犾犻狀犮狅狊犿犲狋犻犮狊犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犔犻狇狌犻犱犮犺狉狅犿犪狋狅犵狉犪狆犺狔２００８０７１７发布２００９０２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准的附录Ａ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中国检验检疫科学研究院负责起草。本标准主要起草人：程艳、王星、武婷、陈伟、林远辉、张帆、刘柳、王超。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２１０４—２００８进出口化妆品中双香豆素和环香豆素的测定液相色谱法１ 范围本标准规定了进出口化妆品中双香豆素和环香豆素的液相色谱测定方法。本标准适用于皮肤护理类、皮肤清洁类、皮肤美容／修饰类进出口化妆品中双香豆素和环香豆素的测定。２ 原理化妆品中的双香豆素和环香豆素用乙腈＋０．１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液（９＋１，体积比）超声提取，过滤后，采用反相高效液相色谱技术进行分离、测定。根据其保留时间定性，外标法定量。３ 试剂和材料除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为二次去离子水。３．１ 乙腈，色谱纯。３．２ 甲醇，优级纯。３．３ 双香豆素，纯度≥９９％。３．４ 环香豆素，纯度≥９９％。３．５ ０．１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液：称取０．４０ｇ氢氧化钠，加水溶解后转移至１００ｍＬ容量瓶中，定容至刻度。３．６ １．０ｍｏｌ／Ｌ乙酸溶液：移取５．７ｍＬ冰醋酸，加水溶解后转移至１００ｍＬ容量瓶中，定容至刻度。３．７ ０．０５ｍｏｌ／Ｌ乙酸铵溶液（含０．２５％体积比的乙酸）：称取３．８５ｇ乙酸铵，加水溶解后转移至１０００ｍＬ容量瓶中，加入２．５ｍＬ冰醋酸，定容，过滤后备用。３．８ 双香豆素和环香豆素标准储备液（１００ｍｇ／Ｌ）：分别准确称取双香豆素（３．３）和环香豆素（３．４）０．０１ｇ，精确至０．０００１ｇ，加入５ｍＬ二氯甲烷，再加入５ｍＬ乙腈（３．１），超声使固体全部溶解，用乙腈定容至１００ｍＬ，冰箱冷藏保存。根据需要用乙腈稀释成适用浓度的标准工作溶液，现用现配。３．９ 乙腈＋氢氧化钠溶液：量取乙腈（３．１）９０ｍＬ，加入０．１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液（３．５）１０ｍＬ，混合均匀，配制成１００ｍＬ溶液。４ 仪器４．１ 液相色谱仪：配有二极管阵列检测器。４．２ 微量进样器：１０μＬ。４．３ 超声波清洗器。４．４ 离心机：大于６０００ｒ／ｍｉｎ。４．５ 溶剂过滤器和０．４５μｍ有机过滤膜。５ 测定步骤５．１ 试样处理称取化妆品试样０．５ｇ至聚四氟乙烯容器中，精确到０．００１ｇ，加入乙腈＋氢氧化钠溶液（３．９）１５ｍＬ，在超声波清洗器中超声振荡２０ｍｉｎ后，加入０．１５ｍＬ乙酸溶液（３．６），并用乙腈＋氢氧化钠溶１犛犖／犜２１０４—２００８液（３．９）定容至２５ｍＬ，混匀。取部分溶液放入离心管中，在离心机上于６０００ｒ／ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，离心后的上清液经０．４５μｍ有机滤膜过滤，滤液待测定用。５．２ 样品测定５．２．１ 色谱条件５．２．１．１ 色谱柱：ＫｒｏｍａｓｉｌＣ１８柱［２５０ｍｍ×４．６ｍｍ（内径），５μｍ，或相当者］。５．２．１．２ 流动相：（Ａ）相：５％甲醇（３．２）＋９５％乙腈（３．１）；（Ｂ）相：５％甲醇（３．２）＋９５％的０．０５ｍｏｌ／Ｌ乙酸铵溶液（含０．２５％体积比的乙酸）（３．７）。５．２．１．３ 梯度条件：如表１所示。表１ 梯度洗脱条件时间／ｍｉｎＡ／％Ｂ／％０５３４７２５３４７３７９２１１０７９２１１２５３４７５．２．１．４ 流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ。５．２．１．５ 检测波长：３０６ｎｍ。５．２．１．６ 柱温：室温。５．２．１．７ 进样量：１０μＬ。５．２．２ 标准工作曲线绘制分别移取双香豆素和环香豆素标准储备液（３．８）配制成０．１０，０．５０，１．０，１０，２０，５０ｍｇ／Ｌ标准工作溶液。取１０μＬ注入液相色谱仪，按色谱条件（５．２．１）进行测定，以色谱峰的峰面积为纵坐标，与其对应的浓度为横坐标作图，绘制标准工作曲线。标准物质色谱图参见附录Ａ。５．２．３ 试样测定用微量进样器准确吸取１０μＬ试样溶液（５．１）注入液相色谱仪，按色谱条件（５．２．１）进行测定，记录色谱峰的保留时间和峰面积，由色谱峰的峰面积可从标准曲线上求出相应的被测物浓度。样品溶液中双香豆素和环香豆素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。双香豆素和环香豆素含量高的试样可取适量试样溶液用乙腈稀释后进行测定。６ 结果计算化妆品中的双香豆素和环香豆素的含量按式（１）计算：犡＝犮×犞犿×１０００……………………………（１）式中：犡———化妆品中双香豆素和环香豆素的质量含量，单位为毫克每千克（ｍｇ／ｋｇ）；犮———从工作曲线上查出的样品溶液中双香豆素和环香豆素的浓度，单位为毫克每升（ｍｇ／Ｌ）；犞———试样定容体积，单位为升（Ｌ）；犿———试样的质量，单位为克（ｇ）。７ 测定低限本方法对双香豆素的测定低限为５．０ｍｇ／ｋｇ；对环香豆素的测定低限为５．０ｍｇ／ｋｇ。２犛犖／犜２１０４—２００８８ 回收率和精密度双香豆素和环香豆素含量在５．０ｍｇ／ｋｇ～１０００ｍｇ／ｋｇ范围的回收率和精密度如表２所示。表２ 双香豆素和环香豆素的回收率和精密度名 称添加浓度／（ｍｇ／ｋｇ）平均回收率／％相对标准偏差／％双香豆素５．０１０２．９１．３３５０．０９９．３１．５０１０００９９．５２．１７环香豆素５．０９８．１４．７８５０．０９７．９４．９３１０００１００．４１．８０犛犖／犜２１０４—２００８书书书犛犖／犜２１０４—２００８附 录 犃（资料性附录）标准物质液相色谱图 １———双香豆素（３．７０ｍｉｎ）； ２———环香豆素（９．６９ｍｉｎ）。图犃．１ 双香豆素和环香豆素标准物质液相色谱图８００２—４０１２犜／犖犛