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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２０９６—２００８食品中丙烯酰胺的检测方法同位素内标法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犪犮狉狔犾犪犿犻犱犲犻狀犳狅狅犱—犐狊狅狋狅狆犲犻狀狋犲狉狀犪犾狊狋犪狀犱犪狉犱２００８０７１７发布２００９０２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言本标准的附录Ａ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准由中国检验检疫科学研究院负责起草。本标准主要起草人：仲维科、李翔、李礼、刘汉霞、陈冬东、雍炜、邱月明。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２０９６—２００８食品中丙烯酰胺的检测方法同位素内标法１ 范围本标准规定了油炸和焙烤食品中丙烯酰胺的检测方法。本标准适用于油炸和焙烤食品中丙烯酰胺的检测。２ 测定方法２．１ 方法提要用水提取试样中的丙烯酰胺，提取液经石墨化碳黑层析柱净化，净化液中的丙烯酰胺经溴水衍生化后，用同位素标记的内标法，气相色谱质谱联用仪（ＧＣＭＳ）检测。２．２ 试剂和材料除另有说明，所用试剂均为分析纯，水为去离子水或相当纯度的水。２．２．１ 正己烷：重蒸馏。２．２．２ 乙酸乙酯：重蒸馏。２．２．３ 丙烯酰胺标准品：纯度≥９９％。２．２．４ （１３Ｃ）标记的丙烯酰胺标准品：１０００ｍｇ／Ｌ。２．２．５ 丙烯酰胺标准溶液：准确称取适量的丙烯酰胺标准品（精确至０．１ｍｇ），用水溶解，配制成浓度为１０ｍｇ／Ｌ的标准储备溶液。根据需要用水稀释成适用浓度的标准工作溶液。２．２．６ （１３Ｃ）标记的丙烯酰胺标准溶液：移取（１３Ｃ）标记的丙烯酰胺标准品１ｍＬ，用水配制成浓度为１０ｍｇ／Ｌ的标准储备溶液。根据需要用水稀释成适用浓度的标准工作溶液。２．２．７ 无水硫酸钠：６５０℃灼烧４ｈ，置于干燥器内保存。２．２．８ 石墨化碳黑固相萃取柱：内填石墨化碳黑５００ｍｇ，使用前分别用５ｍＬ甲醇和５ｍＬ水活化。２．２．９ 溴水：含溴浓度≥３％。２．２．１０ 氢溴酸：浓度≥４０．０％。２．２．１１ 玻璃棉。２．２．１２ 硫代硫酸钠水溶液：０．２ｍｏｌ／Ｌ。２．３ 仪器和设备２．３．１ 气相色谱质谱仪，带ＥＩ源。２．３．２ 旋转蒸发器。２．３．３ 振荡器。２．３．４ 冷冻离心机。２．３．５ 氮吹仪。２．３．６ 固相提取装置。２．３．７ 天平（精确到０．００１ｇ）。２．４ 测定步骤２．４．１ 提取准确称取已粉碎的样品２０ｇ（精确至１ｍｇ）于（２５０ｍＬ）三角瓶中，加水１００ｍＬ，加１ｍＬ浓度为５００ｎｇ／ｍＬ１３Ｃ３同位素标记的丙烯酰胺内标，振荡３０ｍｉｎ，取上清液２５ｍＬ于５０ｍＬ离心管中，加入１犛犖／犜２０９６—２００８正己烷２０ｍＬ，振荡１０ｍｉｎ，离心（３０００ｒ／ｍｉｎ）５ｍｉｎ，弃去正己烷层。２．４．２ 净化将离心管在１２０００ｒ／ｍｉｎ下，于４℃高速冷冻离心３０ｍｉｎ，上清液用玻璃棉过滤，将滤液加入石墨化碳黑固相萃取柱中，收集流出液，再用２０ｍＬ纯净水淋洗，合并流出液和淋洗液用于衍生化。２．４．３ 衍生化在净化液中加入７．５ｇ溴化钾，用氢溴酸调节净化液至ｐＨ１～３，再加８ｍＬ溴水，在４℃条件下衍生过夜。滴加硫代硫酸钠溶液至黄色消失以除去残余的溴。将溶液转移到分液漏斗中，加２０ｍＬ乙酸乙酯，振荡１０ｍｉｎ，静置分层，再分别用１０ｍＬ乙酸乙酯提取两次，合并乙酸乙酯提取液。乙酸乙酯过无水硫酸钠后，旋转浓缩并定容至１．０ｍＬ，供气相色谱质谱测定。２．４．４ 测定２．４．４．１ 仪器条件ａ） 色谱柱：ＨＰ５３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）×０．２５μｍ（膜厚），ＨＰ５（或相当者）；ｂ） 色谱柱温度：６５℃（１ｍｉｎ→）１５℃／→ｍｉｎ２８０℃（１５ｍｉｎ）；ｃ） 进样口温度：２８０℃；ｄ） 离子源温度：２３０℃；ｅ） 传输线温度：２８０℃；ｆ） 离子源：ＥＩ源；ｇ） 测定方式：选择离子监测方式；ｈ） 选择监测离子（ｍ／ｚ）：１０６、１５０、１５２、１１０、１５３、１５５；ｉ） 载气：氦气，纯度９９．９９９％，流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ；ｊ） 进样方式：无分流进样；ｋ） 进样量：１．０μＬ；ｌ） 电子能量：７０ｅＶ。２．４．４．２ 色谱质谱确证和测定在上述仪器条件下经衍生化的丙烯酰胺保留时间约为８．２６ｍｉｎ。气相色谱质谱选择离子总离子流图参见附录Ａ图Ａ．１。符合下列条件，即可确定样品中含有丙烯酰胺：在保留时间８．２６ｍｉｎ附近有峰出现，选定的质谱碎片离子在样品的选择离子质谱图中都能出现，样品峰的质谱图中各碎片离子的相对丰度为：１５３∶１５５＝１，１５０∶１５２＝１，１０６∶１５０＝０．６，１１０∶１５３＝０．６，以上离子相对丰度的偏差比不超过２０％。以１５０和１５３定量。气相色谱质谱图参见附录Ａ中图Ａ．２和图Ａ．３。２．４．５ 空白试验除不加试样外，按上述测定步骤进行。２．５ 结果计算和表示２．５．１ 丙烯酰胺和其同位素内标的相对校正因子，按式（１）计算：犚＝犃ｎ×犮ｌ犃ｌ×犮ｎ……………………………（１） 式中：犚———丙烯酰胺和其同位素内标的相对校正因子；犃ｎ———丙烯酰胺标样的峰面积（峰高）；犃ｌ———同位素内标的峰面积（峰高）；犮ｎ———丙烯酰胺标样的浓度，单位为纳克每毫升（ｎｇ／ｍＬ）；犮ｌ———同位素内标的浓度，单位为纳克每毫升（ｎｇ／ｍＬ）。２．５．２ 试样中丙烯酰胺的残留含量，按式（２）计算（计算结果需将空白值扣除）：犡＝犃ｓｎ×犿ｓｌ犃ｓｌ×犚×犿……………………………（２）２犛犖／犜２０９６—２００８ 式中：犡———试样中丙烯酰胺含量，单位为纳克每克（ｎｇ／ｇ）；犚———丙烯酰胺和其同位素内标的相对校正因子；犃ｓｎ———实际样品丙烯酰胺衍生物的峰面积（峰高）；犃ｓｌ———实际测定时同位素内标的峰面积（峰高）；犿ｓｌ———实际测定时同位素内标的量，单位为纳克（ｎｇ）；犿———样品的质量，单位为克（ｇ）。３ 测定低限、回收率、精密度３．１ 最低检出限本标准测定低限为：５ｎｇ／ｇ。３．２ 回收率丙烯酰胺添加浓度在５ｎｇ／ｇ～１０００ｎｇ／ｇ范围，回收率为８５％～１０６％。３．３ 精密度样品添加浓度５ｎｇ／ｇ，相对标准偏差为６．０％；添加浓度１０００ｎｇ／ｇ，相对标准偏差为５．９％。３犛犖／犜２０９６—２００８附 录 犃（资料性附录）标准物气相色谱质谱图图犃．１ 丙烯酰胺标准品衍生物气相色谱质谱选择离子总离子流图（犜犐犆）图犃．２ 丙烯酰胺衍生物标准品气相色谱全扫描质谱图４犛犖／犜２０９６—２００８图犃．３ 丙烯酰胺和其同位素的标记的丙烯酰胺质谱图（犛犐犕）５犛犖／犜２０９６—２００８