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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２０９７—２００８入出境人员猴痘检验规程犆狅犱犲狊犳狅狉犲狓犪犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犿狅狀犽犲狔狆狅狓犪狋犲狀狋狉狔犲狓犻狋狆狅狉狋２００８０７１７发布２００９０２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国惠州出入境检验检疫局、中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所。本标准主要起草人：幸芦琴、李小波、钟玉清、阮力、师永霞、郭波旋、黄吉城、洪烨、相大鹏、郑夔。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２０９７—２００８入出境人员猴痘检验规程１ 范围本标准规定了入出境口岸入出境人员猴痘病毒的实验室检验方法与结果报告，包括样本采集、处理，检验程序、方法，结果判定及报告。本标准适用于入出境口岸猴痘病毒的实验室检验。２ 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。２．１猴痘 犿狅狀犽犲狔狆狅狓由猴痘病毒（ｍｏｎｋｅｙｐｏｘｖｉｒｕｓ）引起的人兽共患传染病，临床主要表现有高热、头痛、背痛、全身不适、咳嗽、淋巴结肿大，伴全身出现类似天花的皮疹，偶尔出现腹痛。２．２实时荧光 犘犆犚狉犲犪犾狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀犮犲犘犆犚实时荧光ＰＣＲ方法是在常规ＰＣＲ的基础上，加入一条特异性的荧光探针。该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个报告基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；ＰＣＲ扩增时，利用犜犪狇酶的５’３’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，即每扩增一条ＤＮＡ链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与ＰＣＲ产物形成完全同步。２．３犆狋值 犮狔犮犾犲狋犺狉犲狊犺狅犾犱每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。３ 仪器和设备需要如下仪器设备。———Ｒｏｃｈｅ荧光定量ＰＣＲ仪；———生物安全柜；———高压灭菌器；———普通冰箱；———普通台式离心机（带密封的离心安全杯）；———冷冻离心机（带密封的离心安全杯）；———研钵；———涡旋器。４ 试剂４．１ 核酸提取试剂：使用ＴａｋａＲａ基因组ＤＮＡ提取试剂盒１），详见说明书。４．２ ＨｏｔＳｔａｒｔＭｉｘｍａｓｔｅｒ反应试剂盒购自Ｒｏｃｈｅ公司１）。１） 由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。１犛犖／犜２０９７—２００８４．３ 灭菌双蒸水。４．４ 实时荧光ＰＣＲ检测的引物和探针Ｆ３ＬＦ ５’ＣＴＣＡＴＴＧＡＴＴＴＴＴＣＧＣＧＧＧＡＴＡ３’Ｆ３ＬＲ ５’ＧＡＣＧＡＴＡＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧＴＴＧＧＴ３’Ｆ３ＬＰＭＧＢ ５’ＦＡＭＣＡＴＣＡＧＡＡＴＣＴＧＴＡＧＧＣＣＧＴＭＧＢＮＦＱ３’。５ 样本采集５．１ 皮疹、痂皮采集：取皮疹上盖或痂皮，装入２ｍＬ的灭菌塑料管里，密封，４℃或４℃以下保存运输。５．２ 水疱液、脓疱液采集：用附有注射针的一次性注射器吸取０．２ｍＬ的ＰＢＳ，从疱膜插入，来回２次～３次混匀后吸取内容液，把吸取的内容液装入血清管，４℃或４℃以下保存运输。５．３ 全血采集：静脉采集疑似病人抗凝全血５ｍＬ，４℃或４℃以下保存运输。６ 样本处理使用ＴａｋａＲａ基因组ＤＮＡ提取试剂盒制备病毒核酸。６．１ 提取试剂准备（在使用前进行）溶液Ａ、溶液Ｂ若出现沉淀，于６５℃加热溶解，待恢复至室温后使用。６．２ 病毒核酸提取步骤６．２．１ 样本制备６．２．１．１ 皮疹、痂皮等病变组织：取１ｍｇ～１００ｍｇ的病变组织移入冰浴预冷的研钵中，快速用力研成匀浆（富含胶原蛋白的皮肤等组织需加液氮研磨至粉末状）；加入６５０μＬ的溶液Ａ和０．９μＬ的ＲＮａｓｅＡ１，温和研磨３０ｓ；收集６５０μＬ研磨好的组织匀浆移至收集管中，如果匀浆不足６５０μＬ，补充溶液Ａ至６５０μＬ，６５℃水浴５ｍｉｎ。６．２．１．２ 水疱液、脓疱液及病人血液：取２５０μＬ的水疱液、脓疱液及病人全血（含抗凝剂）加入收集管中；加入５００μＬ的溶液Ａ；加入１μＬ的ＲＮａｓｅＡ１，激烈振荡１５ｓ后，冰浴５ｍｉｎ。６．２．２ 加入４００μＬ的溶液Ｂ，振荡混合。６．２．３ 加入１ｍＬ的４℃预冷的溶液Ｃ，充分混匀后，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ。６．２．４ 弃去上层有机相，再加入１ｍＬ的４℃预冷的溶液Ｃ，充分混匀后，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ。６．２．５ 弃去上层有机相，然后将水相溶液（无色下层）转移至置于收集管上的滤杯中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ。６．２．６ 弃滤杯，在溶液中加入４００μＬ的ＤＢ缓冲液，混合均匀。６．２．７ 将试剂盒中的离心柱子安置于收集管上，将上一步的混合溶液转移至离心柱子中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，弃滤液。６．２．８ 将５００μＬ的ＲｉｎｓｅＡ加入至离心柱子中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｓ，弃滤液。６．２．９ 将７００μＬ的ＲｉｎｓｅＢ加入至离心柱子中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｓ，弃滤液。６．２．１０ 重复７．２．９操作一次。６．２．１１ 将离心柱子安置于新的１．５ｍＬ离心管上，在离心柱子膜的中央处加入５０μＬ的ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ，室温静置１ｍｉｎ。６．２．１２ １２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ洗脱ＤＮＡ。７ 实时荧光犘犆犚检测７．１ 实时荧光ＰＣＲ反应液的制备：设置２０μＬ反应体系，每个待检样本反应液的组成为：———无菌水１１．２５μＬ；———２５ｍｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ２２．４μＬ；２犛犖／犜２０９７—２００８———２０μｍｏｌ／ＬＦ３ＬＦ０．７５μＬ；———２０μｍｏｌ／ＬＦ３ＬＲ１μＬ；———１０μｍｏｌ／ＬＦ３ＬＰＭＧＢ０．６μＬ；———Ｈｏｔｓｔａｒｔｍｉｘ２μＬ；———模板２μＬ。７．２ ＰＣＲ反应条件：９５℃１０ｍｉｎ；９５℃１０ｓ，６０℃３０ｓ（ｓｉｎｇｌｅ）５０循环。８ 结果判断使用Ｒｏｃｈｅ荧光定量ＰＣＲ仪进行结果分析时，基线（ｂａｓｅｌｉｎｅ）设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。８．１ 实时荧光ＰＣＲ反应系统的质量控制：反应结果应同时符合以下２个条件，否则实验结果无效。———阴性对照无扩增曲线，为阴性。———阳性对照Ｃｔ小于３５并有明显扩增曲线。８．１．１ 阴性：无Ｃｔ值或Ｃｔ大于等于４５，且无明显扩增曲线，报告为猴痘病毒核酸荧光ＰＣＲ检测阴性。８．１．２ 阳性：Ｃｔ值小于等于４０，并有明显扩增曲线，报告为猴痘病毒核酸荧光ＰＣＲ检测阳性。８．１．３ Ｃｔ值在４０～４５之间的样本建议重做，若重做结果仍然有明显扩增曲线，则该样本判断为猴痘病毒核酸荧光ＰＣＲ检测阳性，否则为阴性。８．２ 本方法的检测灵敏度为１０２ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎ，检测效果最佳模板浓度范围为１０４～１０８ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎ。９ 结果报告阳性样本结果报告：猴痘病毒核酸荧光ＰＣＲ检测阳性。阴性样本结果报告：猴痘病毒核酸荧光ＰＣＲ检测阴性。１０ 生物安全措施根据中华人民共和国卫生部发布的《人间传染的病原微生物名录》规定，猴痘病毒危害程度分类为１类，所有有关猴痘病毒的实验室操作应按照以下规定执行。１０．１ 猴痘病毒培养应在生物安全三级（ＢＳＬ３）实验室内进行。１０．２ 未经培养的感染性材料的操作应在生物安全三级（ＢＳＬ３）实验室内进行。１０．３ 猴痘相关的灭活材料操作应在生物安全二级（ＢＳＬ２）实验室内进行。１０．４ 无感染性材料的操作可在生物安全一级（ＢＳＬ１）实验室内进行。１０．５ 猴痘感染性材料的运输包装分类为Ａ类，ＵＮ编号为ＵＮ２８１４。犛犖／犜２０９７—２００８