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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２０５５—２００８豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犮狅狑狆犲犪狊犲狏犲狉犲犿狅狊犪犻犮狏犻狉狌狊２００８０４２９发布２００８１１０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言本标准的附录Ａ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：李桂芬、李明福、魏梅生、张永江、相宁、王金花。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２０５５—２００８豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法１ 范围本标准规定了豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法。本标准适用于可能带有豇豆重花叶病毒的进境种苗或繁殖材料的检疫和鉴定。２ 原理豇豆重花叶病毒学名：ｃｏｗｐｅａｓｅｖｅｒｅｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，缩写：ＣＰＳＭＶ。豇豆重花叶病毒的生物学、血清学特性是本标准制定的主要依据；该病毒的分类地位、寄主范围、病害症状、地理分布、传播途径、粒体形态等参见附录Ａ。３ 仪器和用具３．１ 仪器３．１．１ 酶标检测仪。３．１．２ 天平（０．００１ｇ）。３．１．３ 水浴锅。３．１．４ 隔离温室。３．２ 用具３．２．１ 可调移液器、可调移液器吸头。３．２．２ 酶联板。３．２．３ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管。３．２．４ 研钵。４ 检疫鉴定方法４．１ 豆类种子检测前的处理应将种子播种在经高温消毒过的土壤中，置隔离温室中培养并观察生长情况，待长有６片～８片真叶时进行检测。首先选择可疑病毒症状植株进行检测，同时也要随机抽取植株样品进行检测。４．２ 双抗体夹心酶联免疫吸附测定法４．２．１ 试材４．２．１．１ 酶联板使用质量有保障厂商生产的酶联板。４．２．１．２ 包被抗体特异性好的抗豇豆重花叶病毒抗体。４．２．１．３ 酶标抗体碱性磷酸酶标记的抗豇豆重花叶病毒抗体。４．２．１．４ 包被缓冲液（狆犎９．６）碳酸钠（Ｎａ２ＣＯ３） １．５９ｇ碳酸氢钠（ＮａＨＣＯ３）２．９３ｇ叠氮化钠（ＮａＮ３）０．２０ｇ１犛犖／犜２０５５—２００８用蒸馏水定容至１Ｌ，４℃储存。４．２．１．５ 洗涤缓冲液（犘犅犛犜、狆犎７．４）氯化钠（ＮａＣｌ）８．０ｇ磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）０．２ｇ磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４）１．１５ｇ氯化钾（ＫＣｌ）０．２ｇ吐温２０（Ｔｗｅｅｎ２０）０．５ｍＬ叠氮化钠（ＮａＮ３）０．２ｇ用蒸馏水定容至１Ｌ。４．２．１．６ 样品抽提缓冲液亚硫酸钠（Ｎａ２ＳＯ３）１．３ｇ聚乙烯基吡咯烷酮（ＰＶＰ，ＭＶ２４０００～４００００）２０ｇ用洗液（ＰＢＳＴ）定溶至１Ｌ，４℃储存。４．２．１．７ 酶标抗体稀释缓冲液聚乙烯基吡咯烷酮（ＰＶＰ，ＭＶ２４０００～４００００）２０ｇ牛血清白蛋白（ＢＳＡ）２ｇ用洗液（ＰＢＳＴ）定溶至１Ｌ，４℃储存。４．２．１．８ 底物缓冲液二乙醇胺（Ｃ４Ｈ１１ＮＯ２）９７ｍＬ蒸馏水（Ｈ２Ｏ）６００ｍＬ用盐酸（ＨＣｌ）调ｐＨ值至９．８，然后用蒸馏水定容至１Ｌ，４℃储存。４．２．２ 实验步骤４．２．２．１ 按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体，每孔加１００μＬ。酶联板加盖或用保鲜膜包好，放在３７℃孵育２ｈ。４．２．２．２ 清空酶联板孔中溶液，用ＰＢＳＴ加满各孔，３ｍｉｎ后倒掉孔中洗涤液，在吸水纸上拍干。再重复２次上述洗板过程。４．２．２．３ 待检样品按１∶（２～１０）（质量浓度）加入样品抽提缓冲液，在研钵中研磨，低速离心，吸取上清液加入到酶联板孔中（１００μＬ／孔），每个待检样品设２个重复，设阳性对照孔、阴性对照孔、缓冲液对照孔。加盖或用保鲜膜包好，４℃冰箱孵育过夜。４．２．２．４ 清空孔中溶液，先在自来水下彻底冲洗３次；然后用ＰＢＳＴ加满各孔，３ｍｉｎ后倒掉，在吸水纸上拍干。再重复２次上述用ＰＢＳＴ的洗板过程。４．２．２．５ 按要求的浓度用酶标抗体稀释缓冲液稀释酶标抗体，每孔加入１００μＬ，加盖或用保鲜膜包好，３７℃孵育４ｈ。４．２．２．６ 清空孔中溶液，先在自来水下彻底冲洗３次；然后用ＰＢＳＴ加满各孔，３ｍｉｎ后倒掉，在吸水纸上拍干。再重复２次上述用ＰＢＳＴ的洗板过程。４．２．２．７ 按１ｍｇ／ｍＬ的浓度将对硝基苯磷酸二钠盐溶于底物溶液中（使用前配制并注意避光以防变色）制成底物溶液。每孔加入１００μＬ底物溶液。加盖或用保鲜膜包好，室温避光孵育至颜色合适时读数。４．２．２．８ 酶标检测仪４０５ｎｍ波长下测定各孔的吸收值。４．２．３ 结果判定４．２．３．１ 对照孔的犗犇４０５值（缓冲液孔、阴性对照孔及阳性对照孔）应该在质量控制范围内，即：缓冲液２犛犖／犜２０５５—２００８孔和阴性对照孔的犗犇４０５值小于０．１５，当阴性对照孔的犗犇４０５值小于０．０５时，按０．０５计算；阳性对照犗犇４０５值／阴性对照犗犇４０５值大于５；孔的重复性一致。４．２．３．２ 在满足了４．２．３．１质量要求后，结果可判定如下：样品犗犇４０５值／阴性对照犗犇４０５值大于或等于２，判为阳性。必要时需要重复做一次酶联实验，以便排除假阳性反应，得到准确无误的结果。样品犗犇４０５值／阴性对照犗犇４０５值小于２，判为阴性。４．２．３．３ 若满足不了４．２．３．１的质量要求，则不能进行结果判定。４．３ 生物学测定４．３．１ 试材４．３．１．１ 鉴别寄主苋色藜（犆犺犲狀狅狆狅犱犻狌犿犪犿犪狉犪狀狋犻犮狅犾狅狉）、菜豆（犘犺犪狊犲狅犾狌狊狏狌犾犵犪狉犻狊）品种Ｐｉｎｔｏ、豇豆（犞犻犵狀犪狌狀犵狌犻犮狌犾犪狋犪）品种ＢｌａｃｋｅｙｅＥａｒｌｙＲａｍｓｈｏｒｎ。４．３．１．２ 研磨缓冲液０．０１ｍｏｌ／Ｌ磷酸钠缓冲液（ｐＨ７．２）４．３．１．３ 硅藻土。４．３．２ 方法４．３．２．１ 研磨样品按１∶（２～１０）（质量浓度）加入研磨缓冲液，在研钵中研碎。研碎后放入硅藻土（浓度为０．５％）并与病汁液混匀。４．３．２．２ 接种苋色藜接种苗龄：４片～６片真叶。菜豆（犘犺犪狊犲狅犾狌狊狏狌犾犵犪狉犻狊）品种Ｐｉｎｔｏ接种苗龄：子叶期或第一片真叶出现。豇豆（犞犻犵狀犪狌狀犵狌犻犮狌犾犪狋犪）品种ＢｌａｃｋｅｙｅＥａｒｌｙＲａｍｓｈｏｒｎ接种苗龄：子叶期或第一片真叶出现。先将要接种的植株叶片用牙签等穿孔作为接种叶片的标记，然后用手将样品汁液轻轻涂抹于鉴别寄主叶片上表面。４．３．２．３ 冲洗用蒸馏水冲洗叶表面。４．３．２．４ 标记做好标签，置于隔离温室中。４．３．２．５ 隔离温室条件控制在自然光照下，温度控制在２０℃～３０℃。４．３．２．６ 观察及时观察记载寄主反应。４．３．３ 鉴别寄主症状苋色藜：接种叶出现坏死斑症状，没有系统症状。菜豆（品种Ｐｉｎｔｏ）：接种叶出现坏死斑症状，没有系统症状。豇豆（品种ＢｌａｃｋｅｙｅＥａｒｌｙＲａｍｓｈｏｒｎ）：接种叶出现褪绿斑症状，并且通常有红色坏死斑，有的主要叶脉变成红色和坏死，系统症状为花叶、黄脉、畸形、坏死。５ 检疫鉴定结果判定样品酶联检测结果为阳性，生物学测定鉴别寄主反应与描述相吻合，可判定待检测样品带有豇豆重花叶病毒。３犛犖／犜２０５５—２００８６ 样品保存种子类样品保存６个月，如果发现带毒样品保存１年。豆类植株中发现病毒的，采集病叶干燥后放－２０℃保存。检测原始记录、照片等文档按有关规定做好登记、标记和存档，以便必要时复核。４犛犖／犜２０５５—２００８附 录 犃（资料性附录）豇豆重花叶病毒的背景资料犃．１ 分类地位豇豆花叶病毒科（Ｃｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ），豇豆花叶病毒属（犆狅犿狅狏犻狉狌狊）。犃．２ 寄主范围犃．２．１ 自然寄主毛蔓豆（犆犪犾狅狆狅犵狅狀犻狌犿犿狌犮狌狀狅犻犱犲狊），直生刀豆（犆犪狀犪狏犪犾犻犪犲狀狊犻犳狅狉犿犻狊），距瓣豆（犆犲狀狋狉狅狊犲犿犪狆狌犫犲狊犮犲狀狊），菽麻（犆狉狅狋犪犾犪狉犻犪犼狌狀犮犲犪），犇犲狊犿狅犱犻狌犿犮犪狀犲狊犮犲狀狊，大豆（犌犾狔犮犻狀犲犿犪狓），大翼豆（犕犪犮狉狅狆狋犻犾犻狌犿犾犪狋犺狔狉狅犻犱犲狊），菜豆（犘犺犪狊犲狅犾狌狊狏狌犾犵犪狉犻狊），四棱豆（犘狊狅狆犺狅犮犪狉狆狌狊狋犲狋狉犪犵狅狀狅犾狅犫狌狊），绿豆（犞犻犵狀犪狉犪犱犻犪狋犪），豇豆（犞犻犵狀犪狌狀犵狌犻犮狌犾犪狋犪），犆狉狅狋犪犾犪狉犻犪狆犪狌犾犻狀犲犪。犃．２．２ 试验寄主试验寄主有３科～９科植物。豆科：木豆犆犪犼犪狀狌狊犮犪犼犪狀、豌豆犘犻狊狌犿狊犪狋犻狏狌犿、印度麻犆狉狅狋犪犾犪狉犻犪犼狌狀犮犲犪、犇犲狊犿狅犱犻狌犿犮犪狀犲狊犮犲狀狊、犛犲狊犫犪狀犻犪犲狓犪犾狋犪狋犪、绛车轴草犜狉犻犳狅犾犻狌犿犻狀犮犪狉狀犪狋狌犿、望江南犆犪狊狊犻犪狅犮犮犻犱犲狀狋犪犾犻狊。夹竹桃科：长春花犆犪狋犺犪狉犪狀狋犺狌狊狉狅狊犲狌狊。藜科：藜犆犺犲狀狅狆狅犱犻狌犿犪犾犫狌犿、苋色藜犆犺犲狀狅狆狅犱犻狌犿犪犿犪狉犪狀狋犻犮狅犾狅狉、犆犺犲狀狅狆狅犱犻狌犿犮犪狆犻狋犪狋狌犿、昆藜犆犺犲狀狅狆狅犱犻狌犿狇狌犻狀狅犪。茄科：曼陀罗犇犪狋狌狉犪狊狋狉犪犿狅狀犻狌犿、克里夫兰烟犖犻犮狅狋犻犪狀犪犮犾犲狏犲犾犪狀犱犻犻、矮牵牛犘犲狋狌狀犻犪犺狔犫狉犻犱犪、普通烟犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿、心叶烟犖犻犮狅狋犻犪狀犪犵犾狌狋犻狀狅狊犪。苋科：千日红犌狅犿狆犺狉犲狀犪犵犾狅犫狅狊犪。犃．３ 病害症状几乎所有的寄主在接种叶上形成褪绿斑或坏死斑，系统症状为斑驳或花叶，幼叶通常形成明显疱状突起、畸形。一些寄主表现系统坏死。在巴西，受侵染的大豆出现植株矮化、芽枯、结荚数减少、产量降低。毛蔓豆出现严重花叶和疱状突起；距瓣豆出现褪绿和花叶症状；菽麻叶片出现褪绿斑驳和畸形或褪绿斑症状；绿豆叶片出现轻花叶和坏死斑症状；豇豆叶片出现褪绿花叶和严重畸形。犃．４ 地理分布美国、特立尼达（特立尼达和多巴哥共和国）、波多黎各岛、萨尔瓦多、哥斯达黎加、委内瑞拉、苏里南、巴西、秘鲁、墨西哥。犃．５ 传播途径机械传播；花粉、种子传播；甲虫传播，主要是叶甲科甲虫传播，大约有１０种，其中犆犲狉狅狋狅犿犪狉狌犳犻犮狅狉狀犻狊、犆．狋狉犻犳狌狉犮犪狋犪是最重要的传播介体。５犛犖／犜２０５５—２００８犃．６ 粒体形态豇豆重花叶病毒粒子为等轴对称二十面体，直径２５ｎｍ，无包膜。６犛犖／犜２０５５—２００８