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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２０５８—２００８进出口蜂王浆中氯霉素残留量测定方法酶联免疫法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犮犺犾狅狉犪犿狆犺犲狀犻犮狅犾狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀狉狅狔犪犾犼犲犾犾狔犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犈狀狕狔犿犲犾犻狀犽犲犱犻犿犿狌狀狅狊狅狉犫犲狀狋犪狊狊犪狔２００８０４２９发布２００８１１０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准的附录Ａ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张晓峰、施伟良、朱振江、方莹、董强。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２０５８—２００８进出口蜂王浆中氯霉素残留量测定方法酶联免疫法１ 范围本标准规定了蜂王浆及冻干粉中氯霉素残留量的酶联免疫测定方法。本标准适用于蜂王浆及冻干粉中氯霉素残留量的测定。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法（ＧＢ／Ｔ６６８２—１９９２，ｎｅｑＩＳＯ３６９６：１９８７）３ 方法提要本标准以三氯乙酸来沉淀蜂王浆中的蛋白质和提取残留的氯霉素，然后以ＨＬＢ净化。微孔板中包被有绵羊抗兔ＩｇＧ抗体，加入特异性抗体（兔抗氯霉素抗体）、酶标记氯霉素、氯霉素标准品或样品提取液后，特异性抗体与包被的绵羊抗兔ＩｇＧ抗体结合，同时游离氯霉素和酶标记氯霉素竞争性的与特异性抗体结合。通过洗涤除去未结合的氯霉素和酶标记氯霉素，然后加入底物显色，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中氯霉素的含量。４ 试剂和材料除注明外，所有试剂均为分析纯，水为ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。４．１ 氯霉素检测试剂盒（参见附录Ａ）。４．２ 甲醇。４．３ ５％三氯乙酸：５．０ｇ三氯乙酸以水溶解并定容至１００ｍＬ。４．４ ３０％甲醇：３０．０ｍＬ甲醇（４．２）以水定容至１００ｍＬ。４．５ 异辛烷三氯甲烷混合液：异辛烷、三氯甲烷以２∶３（体积比）的比例混合。４．６ ＨＬＢ小柱：Ｏａｓｉｓ（或相当产品），３ｍＬ（６０ｍｇ）。４．７ 氯霉素标准品：纯度≥９８％。４．８ 氯霉素标准品溶液的配制：称取０．０１ｇ氯霉素标准品，以甲醇定容至１００ｍＬ，配制１００μｇ／ｍＬ的工作液，于４℃～８℃条件下保存。４．９ 空白样品：选用已确切知道不含有氯霉素的蜂王浆样品，作为空白样品。用于随样测试的加标监控实验。５ 仪器５．１ 酶标仪。５．２ ８道移液器：１０μＬ～１００μＬ。５．３ 单道移液器：１０μＬ～１００μＬ，２０μＬ～２００μＬ，１００μＬ～１０００μＬ和２ｍＬ～１０ｍＬ。５．４ 混合振荡器。１犛犖／犜２０５８—２００８５．５ 高速低温离心机：６０００ｒ／ｍｉｎ。５．６ 固相萃取装置。５．７ 氮吹仪。５．８ 具塞试管：５０ｍＬ。５．９ 电子天平：０．０１ｇ～１００ｇ。６ 试样的制备和保存６．１ 试样的制备原始样品总量不得少于２００ｇ，蜂王浆充分搅拌均匀后，将样品分成两等份；冻干粉采用四分法，将样品分成两等份。分好的样品装入洁净容器，加封并做标识。６．２ 试样的保存试样放置－２０℃～－１８℃条件下保存。７ 分析步骤１）７．１ 提取称取２．０ｇ王浆样品，置于５０ｍＬ具塞试管中，加入８ｍＬ５％三氯乙酸（４．３），充分混匀，６０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上层液备用。ＨＬＢ小柱（４．６）依次用１ｍＬ甲醇（４．２）和１ｍＬ水活化，取２．５ｍＬ上层液上柱，依次以３ｍＬ水，１ｍＬ３０％甲醇（４．４）洗柱，去除残留的液体，再用２ｍＬ甲醇（４．２）洗脱，将洗脱液收集于一干净试管，氮气吹干，以０．５ｍＬ样品稀释缓冲液（试剂盒提供）溶解残留物，最后加入０．５ｍＬ异辛烷三氯甲烷混合液（４．５）萃取，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上层水相进行分析供ＥＬＩＳＡ检测用，最后稀释倍数为１。王浆冻干粉则用水以１∶２比例稀释，充分浸泡（２ｈ以上）后，称取２．０ｇ按照上述王浆前处理方法进行提取，最后稀释倍数为３。１） 给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品操作步骤的认可。如果其他产品的操作步骤有不同，需经实验评估后采用。７．２ 测定条件７．２．１ 酶标仪测定条件酶标仪测定波长为４５０ｎｍ。７．２．２ 洗板条件人工洗涤次数５次以上，每次加入洗涤液量为２５０μＬ。自动洗板可以预定５次周期。７．２．３ 操作条件所有操作应在室温下（２０℃～２４℃）进行，氯霉素试剂盒中所有试剂的温度均应回升至室温（２０℃～２４℃）后方可使用。７．３ 测定步骤７．３．１ 将测定需用的微孔板备齐并插入微孔架上，记录标准品及样品等在微孔架上的位置。７．３．２ 吸取１００μＬ零标准缓冲液于孔Ａ１、Ａ２；并吸取５０μＬ零标准缓冲液于孔Ｂ１、Ｂ２；分别吸取５０μＬ氯霉素标准溶液（浓度分别为：０．０２５、０．０５、０．１、０．２、０．５、２．０ｎｇ／ｍＬ）于孔Ｃ１、Ｃ２—Ｈ１、Ｈ２；吸取５０μＬ样品溶液于其余微孔中。测定中吸取不同的试剂和样品溶液时应更换吸头。７．３．３ 分别吸取２５μＬ氯霉素酶标记物溶液于除Ａ１、Ａ２外的每一个微孔。７．３．４ 分别吸取２５μＬ氯霉素抗体溶液于除Ａ１、Ａ２外的每一个微孔。７．３．５ 用封口膜封孔条，并持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀。７．３．６ 将酶标板置于４℃避光温育１ｈ。７．３．７ 倒出孔中的液体，将微孔架反扣在吸水纸上反复拍打，以除去孔中过多的残液，但不能使微孔干２犛犖／犜２０５燥，然后，立即用洗涤缓冲液按７．２．２条件进行洗板。要注意不能使微孔干燥。７．３．８ 迅速加入１００μＬ底物溶液于每一个微孔底部，然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，于２０℃～２４℃避光温育３０ｍｉｎ。７．３．９ 迅速加入１００μＬ反应终止液于每一个微孔，然后，持微孔板在台面上以圆周运动方式混匀后，将微孔架置于酶标仪中，在４５０ｎｍ处测量吸光度（应在加入反应终止液３０ｍｉｎ内读取吸光度）。７．４ 平行试验按以上步骤，对同一标准溶液、同一样品溶液均应进行平行试验测定。７．５ 空白试验除不称取试样外，均按上述步骤进行。７．６ 阳性质控每次测定均应做一个用空白样品添加氯霉素标准（４．８）的监控样品测定，以确定实验过程的准确性。８ 结果计算从含有标准品和待测样品的吸光度（ＯＤ）值中，减去空白孔Ａ１、Ａ２的平均ＯＤ值。标准品和待测样品的ＯＤ平均值除以零标准（Ｂ１、Ｂ２）的平均ＯＤ值，再乘以１００。计算出各标准液和样品的百分比吸光度值。零标准为１００％（最大百分比吸光度值），其他ＯＤ值为最大吸光度值的百分数。以吸光度百分比值（犅／犅０）为纵坐标（％），氯霉素标准溶液浓度（ｎｇ／ｍＬ）对数值为横坐标，绘制标准工作曲线。从标准工作曲线上得到试样中相应的氯霉素浓度后，结果按式（１）进行计算：犡＝犮×犞×１０００犿×１０００……………………………（１）式中：犡———样品中氯霉素的残留量，单位为微克每千克（μｇ／ｋｇ）；犮———从标准工作曲线上得到的样品中氯霉素浓度，单位为纳克每毫升（ｎｇ／ｍＬ）；犞———样品溶液的最终定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；犿———样品溶液所代表的最终试样质量，单位为克（ｇ）。也可以用各种酶标仪的数据处理软件进行计算，所得结果表示至一位小数。９ 确证试验如被测样品中为阳性结果时，应用其他方法进行确证。１０ 本方法测定低限和回收率１０．１ 方法测定低限０．３μｇ／ｋｇ。１０．２ 回收率本方法中氯霉素添加浓度及回收率的试验数据：———添加量为０．３μｇ／ｋｇ时，平均回收率为８０％～９０％；———添加量为３μｇ／ｋｇ时，平均回收率为８３％～９６％；———添加量为１０μｇ／ｋｇ时，平均回收率为８５．７％～９９．６％。３犛犖／犜２０５８—２００８附 录 犃（资料性附录）氯霉素试剂盒（荷兰犈犝犚犗犇犐犃犌犖犗犛犜犐犆犃公司产品）２）犃．１ 试剂盒组成犃．１．１ 预包被抗体的９６孔板：１２条×８孔。犃．１．２ 氯霉素标准溶液：０．０２５、０．０５、０．１、０．２、０．５、２和１００ｎｇ／ｍＬ。犃．１．３ 重组／零标准缓冲液。犃．１．４ 氯霉素酶标记物冻干粉：根据氯霉素试剂盒中说明，可用重组／零标准缓冲液配制成氯霉素酶标记物溶液。犃．１．５ 抗氯霉素抗体冻干粉：根据氯霉素试剂盒中说明，可用重组／零标准缓冲液配制成抗氯霉素抗体溶液。犃．１．６ 底物ＴＭＢ溶液。犃．１．７ 稀释缓冲液：可用水４倍稀释后使用。犃．１．８ 洗涤浓缩液：可用水１０倍稀释后使用。犃．１．９ 反应终止液。试剂盒应在４℃～８℃避光条件下保存，溶解后的酶标记物和抗体溶液需－１５℃条件冻存。犃．２ 标准校正曲线标准校正曲线见图Ａ．１。狔＝－１４．０４１ｌｎ狓＋１８．２３３犚２＝０．９８８２图犃．１ 标准校正曲线２） 给出该信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对某一产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，需经实验评估后使用这些等效产品。４犛犖／犜２０５８—２００８犉狅狉犲狑狅狉犱犃狀狀犲狓犃狅犳狋犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犪狉犲犻狀犳狅狉犿犪狋犻狏犲犪狀狀犲狓狊．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊狆狉狅狆狅狊犲犱犫狔犆犲狉狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱犃犮犮狉犲犱犻狋犪狋犻狅狀犃犱犿犻狀犻狊狋狉犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲犘犲狅狆犾犲’狊犚犲狆狌犫犾犻犮狅犳犆犺犻狀犪．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊犿犪犻狀犾狔犱狉犪犳狋犲犱犫狔犣犺犲犼犻犪狀犵犈狀狋狉狔犈狓犻狋犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲犅狌狉犲犪狌狅犳狋犺犲犘犲狅狆犾犲’狊犚犲狆狌犫犾犻犮狅犳犆犺犻狀犪．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊犿犪犻狀犾狔犱犪犳狋犲犱犫狔犉犲狀犵狓犻犪狅犣犺犪狀犵，犠犲犻犾犻犪狀犵犛犺犻，犣犺犲狀犼犻犪狀犵犣犺狌，犢犻狀犵犉犪狀犵，犙犻犪狀犵犇狅狀犵．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犻狊狆狉狅犳犲狊狊犻狅狀犪犾狊狋犪狀犱犪狉犱狅犳犈狀狋狉狔犈狓犻狋犻狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱狇狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅犿狌犾犵犪狋犲犱犳狅狉狋犺犲犳犻狉狊狋狋犻犿犲．５犛犖／犜２０５８—２００８犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犮犺犾狅狉犪犿狆犺犲狀犻犮狅犾狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀狉狅狔犪犾犼犲犾犾狔犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犈狀狕狔犿犲犾犻狀犽犲犱犻犿犿狌狀狅狊狅狉犫犲狀狋犪狊狊犪狔１ 犛犮狅狆犲犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狊狆犲犮犻犳犻犲狊狋犺犲犿犲狋犺狅犱狊狅犳犱犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀犫狔犈犔犐犛犃犿犲狋犺狅犱狅犳犮犺犾狅狉犪犿狆犺犲狀犻犮狅犾狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀狉狅狔犪犾犼犲犾犾狔犪狀犱狉狅狔犪犾犼犲犾犾狔狆狅狑犱犲狉．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犻狊犪狆狆犾犻犮犪犫犾犲狋狅狋犺犲狊犮狉犲犲狀犱犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犮犺犾狅狉犪犿狆犺犲狀犻犮狅犾狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀狉狅狔犪犾犼犲犾犾狔狉狅狔犪犾犼犲犾犾狔狆狅狑犱犲狉．２ 犖狅狉犿犪狋犻狏犲狉犲犳犲狉犲狀犮犲狊犜犺犲犳狅犾犾狅狑犻狀犵狀狅狉犿犪狋犻狏犲犱狅犮狌犿犲狀狋狊犮狅狀狋犪犻狀狆狉狅狏犻狊犻狅狀狊狑犺犻犮犺，狋犺狉狅狌犵犺狉犲犳犲狉犲狀犮犲犻狀狋犺犻狊狋犲狓狋，犮狅狀狊狋犻狋狌狋犲狆狉狅狏犻狊犻狅狀狊狅犳狋犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱．犉狅狉犱犪狋犲犱狉犲犳犲狉犲狀犮犲狊，狊狌犫狊犲狇狌犲狀狋犪犿犲狀犱犿犲狀狋狊狋狅，狅狉狉犲狏犻狊犻狅狀狊狅犳，犪狀狔狅犳狋犺犲狊犲狆狌犫犾犻犮犪狋犻狅狀狊犱狅狀狅狋犪狆狆犾狔．犎狅狑犲狏犲狉狆犪狉狋犻犲狊狋狅犪犵狉犲犲犿犲狀狋狊犫犪狊犲犱狅狀狋犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犪狉犲犲狀犮狅狌狉犪犵犲犱狋狅犻狀狏犲狊狋犻犵犪狋犲狋犺犲狆狅狊狊犻犫犻犾犻狋狔狅犳犪狆狆犾狔犻狀犵狋犺犲犿狅狊狋狉犲犮犲狀狋犲犱犻狋犻狅狀狊狅犳狋犺犲狀狅狉犿犪狋犻狏犲犱狅犮狌犿犲狀狋狊犻狀犱犻犮犪狋