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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２０６３—２００８进出口蜂王浆中氯霉素残留量的检测方法液相色谱串联质谱法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犮犺犾狅狉犪犿狆犺犲狀犻犮狅犾狉犲狊犻犱狌犲犻狀狉狅狔犪犾犼犲犾犾狔犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犔犆犕犛／犕犛２００８０４２９发布２００８１１０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前!!言本标准的附录!和附录均为资料性附录!本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口!本标准起草单位中华人民共和国浙江出入境检验检疫局!本标准主要起草人谢文#丁慧瑛#钱艳#奚君阳#陈笑梅#黄雷芳!本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准!!!!#!#$!%进出口蜂王浆中氯霉素残留量的检测方法液相色谱串联质谱法&!范围本标准规定了蜂王浆中氯霉素残留量的制样和液相色谱串联质谱测定方法!本标准适用于蜂王浆中氯霉素残留量的检测!!!方法提要样品用甲醇沉淀蛋白质$再用乙酸乙酯提取$经硅胶和#$%&%’(固相萃取小柱净化$液相色谱串联质谱测定和确证$同位素内标法定量!$!试剂和材料除另有规定外$所有试剂均为分析纯$水为二次蒸馏水!$)&!乙酸乙酯高效液相色谱级!$)!!甲醇高效液相色谱级!$)$!甲苯高效液相色谱级!$)’!氯化钠!$)(!无水硫酸钠*+,-灼烧./$在干燥器内冷却至室温$贮于密封瓶中备用!$)#!甲醇水溶液甲醇0水%123$体积比&!$))!甲苯0乙腈%425$体积比&!$)%!甲苯0乙腈%.2*$体积比&!$)*!氯霉素标准品%6/789$:;/=&687$!?@#)+*0A+0A$55’5171@1#+&纯度大于等于44B!$)&!氯霉素0C+标准品纯度大于等于44B!$)&&!氯霉素标准储备溶液称取适量标准品%D)4&$用甲醇溶解$溶液浓度为5,,E’:(!5-#.-冷藏保存!有效期*个月!$)&!!氯霉素0C+标准储备溶液称取适量标准品%D)5,&$用甲醇溶解$溶液浓度为5,,E’:($5-#.-冷藏保存!有效期*个月!$)&$!标准工作溶液根据需要用空白样品溶液将标准储备液稀释成,),.=E’:(#,)51=E’:(#,)1.=E’:(#,)D1=E’:(#,)*.=E’:(的标准工作溶液$相当于样品中含有,)5E’FE#,)DE’FE#,)*E’FE#,)3E’FE#5)*E’FE氯霉素$同位素内标氯霉素0C+浓度均为,)1+=E’:(!$)&’!无水硫酸钠柱3,::G.,::%内径&筒形漏斗$底部垫+::脱脂棉$再装.,::无水硫酸钠!$)&(!硅胶固相萃取柱+,,:E或相当者$使用前用5,:(甲苯0乙腈%425$体积比&预洗!$)&#!#$%&%’(固相萃取柱+,,:E$或相当者$使用前用甲醇A:(和水5,:(预洗!’!仪器和设备’)&!高效液相色谱0串联质谱仪配有电喷雾离子源!’)!!旋转蒸发器!’)$!旋涡混合器!5!!#!#$!%’)’!固相萃取装置!’)(!高速离心机A,,,9’:&=!’)#!氮吹仪!(!试样制备与保存取+,,E代表性蜂王浆样品$在室温下解冻$等样品全部融化后搅匀$将试样均分成两份$分别装入样品瓶中$密封$并标明标记!一份作为试验样$另一份在H53-保存!在制样的操作过程中$应防止样品污染或发生残留物含量的变化!#!测定步骤#)&!提取称取.E试样%精确到,),5E&置于+,:(具塞离心管中$准确加入,)+:(氯霉素0C+%+=E’:(&内标溶液和5+:(水$混匀$静置+:&=$加甲醇至D,),:($于旋涡混合器上以1,,,9’:&=$混匀5:&=$以*,,,9’:&=离心+:&=$移取5+),:(上层液置于另一个+,:(具塞离心管中$加入1E氯化钠和1,:(乙酸乙酯$于旋涡混合器上以1,,,9’:&=$混匀5:&=$以.,,,9’:&=离心+:&=$将上层乙酸乙酯过无水硫酸钠柱%D)5.&收集于浓缩瓶中$再加入1,:(乙酸乙酯$重复上述操作$合并乙酸乙酯提取液$再用+:(乙酸乙酯洗涤无水硫酸钠柱$在.,-以下水浴减压浓缩至近干!#)!!净化用5,:(乙腈0甲苯%524$体积比&溶液溶解残渣$将溶解液分次转移至硅胶净化柱%D)5+&中$弃去流出液$用*:(乙腈0甲苯%*2.$体积比&洗脱$在+,-以下水浴下平缓氮气吹干$加入+:(水溶解残渣$将溶液转移至#$%&%’(柱%D)5*&中$再用5,:(水和+:(甲醇水溶液%D)*&依次洗涤离心管$洗涤液过固相萃取小柱$弃去流出液!在负压下减压抽干$最后用+:(甲醇洗脱$控制流速5:(’:&=#1:(’:&=$收集全部洗脱液于5,:(离心管中$洗脱液在+,-以下水浴下平缓氮气吹至约1)+:($用水定容至+),:($混匀$将溶液通过,).+:滤膜$供液相色谱0串联质谱仪测定!#)$!测定#)$)&!液相色谱串联质谱条件$&!色谱柱3柱$+:$5+,::G.)*::%内径&或相当者(I&!流动相见表5(表&!流动相梯度洗脱时间’:&=水’B甲醇’B,D+*+.A+1++)4A+1+*D+*+3D+*+!!6&!流速.,,(’:&=(C&!进样量1,((&!离子源电喷雾离子源(J&!扫描方式负离子扫描(E&!检测方式多反应监测(/&!雾化气#气帘气#辅助气#碰撞气均为高纯氮气(使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测要求$参考条件参见附录!(1!!#!#$!%&&!监测离子对%:’K&氯霉素D15),’1+*)4%定量离子&#D15),’5+1),#D15),’54.),#D15),’5A+)3(氯霉素0C+D1*),’5+A)5!#)$)!!液相色谱串联质谱测定根据试样中被测样液的含量情况$选取待测物的响应值在仪器线性响应范围内的浓度进行测定$如超出仪器线性响应范围应进行稀释!在上述色谱条件下氯霉素#氯霉素0C+的参考保留时间约为*)5:&=$标准溶液的选择性离子流图参见附录中图)5!#)$)$!液相色谱串联质谱确证按照液相色谱0串联质谱条件测定样品和标准工作溶液$样品中待测物质的保留时间与标准溶液中待测物质的保留时间偏差在L1)+B之内!定量测定时采用同位素内标标准曲线法!定性时应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致$相对丰度允许偏差不超过表1规定的范围$则可判断样品中存在对应的被测物!表!!定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度’B+,1,#+,5,#1,#5,允许的相对偏差’BL1,L1+LD,L+,#)$)’!空白试验除不加试样外$均按上述操作步骤进行!)!结果计算和表述用色谱数据处理机或按下式计算试样中氯霉素残留含量$计算结果需扣除空白值!%#$%&’&))))))))))%5&&’$!(#($$!($#(’’*$!1($%$!(&1槡+))))))%1&%%$!($&$!(&’’))))))))))%D&!!式中!,,,样品中氯霉素的残留量$单位为微克每千克%E’FE&(!(,,,标准溶液中氯霉素的含量$单位为微克每千克%E’FE&(%,,,工作曲线的截距(&,,,工作曲线的斜率(#,,,样品溶液中氯霉素峰面积’氯霉素0C+峰面积(#(,,,标准溶液中氯霉素峰面积’氯霉素0C+峰面积(’,,,工作曲线包括不同浓度的数目!%!测定低限%$%&&和回收率%)&!测定低限%$%&&测定低限为,)DE’FE!%)!!回收率回收率的实验数据%在不同添加浓度范围内&如下,,,添加浓度在,)DE’FE时$回收率范围为3D)5B#5,*)AB(,,,添加浓度在,)*E’FE时$回收率范围为31)DB#5,*)3B(,,,添加浓度在,)3E’FE时$回收率范围为31)*B#5,A)1B!D!!#!#$!%附!录!’%资料性附录&’()’$*+,!!,!系统电喷雾离子源参考条件&&监测离子对及电压参数$&!电喷雾电压%M?&H.+,,N(I&!雾化气压力%O?5&1*1),5FP$%D3P%&&(6&!气帘气压力%QR&53*)5*+FP$%1AP%&&(C&!辅助气流速%O?1&D5,)1A+FP$%.+P%&&(&!离子源温度%STU&+1+-(J&!碰撞气%!V&.5)DAFP$%*P%&&(E&!离子对#去簇电压%VP&#碰撞气能量%T&及碰撞室出口电压%WP&见表!)5!表’)&!离子对#去簇电压%-(&#碰撞气能量%*.&及碰撞室出口电压%*/(&待!测!物离子对:’K去簇电压%VP&’N碰撞气能量%T&’N碰撞室出口电压%WP&’N氯霉素D15),’1+*)4$H*+H5*H5,D15),’5+1),H*+H1+H5,D15),’54.),H*+H5AH5,D15),’5A+)3H*+H1DH5,氯霉素0C+D1*),’5+A)5$H*+H1+H5,!!$为定量离子对!5&!非商业性声明附录!所列参数是在!PM.,,,质谱仪完成的$此处列出试验用仪器型号仅是为了提供参考$并不涉及商业目的$鼓励标准使用者尝试不同厂家和型号的仪器!.!!#!#$!%附!录!0%资料性附录&氯霉素标准品选择性离子流图图0)&!氯霉素%)!’12!3$&和氯霉素+4(%)!(12!3$&标准品的选择性离子流图+!!#!#$!%!#$%#&’(($)’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’NO,8.#:*14.$(/8/(#6*@$6)3./00-*(&*#&/0*44/8*5$--.$&$-$#1/(*-/(,8.#*14.$(/8#$0/&7$/(#6*@$60*14$)Q!;#/(8/4$N$-.*(/070$&-4#$8/4/-*-$4#-$/()3.$744$#*6$#/0$)-#*8-$&%/-.$-.6*8$-*-$3.$(/-/0$2*4#*-$&*(&8$*($&74%/-.0//8**(&R*0/0FJ+871(0)!/(*6/-/0&$-$#1/($&*(&8(,/#1$&56J:NO’NO)B(-$#(*0-*(&*#&1$-.&/070$&)S!=$*9$(-0*(&1*-$#/*0T($00-.$#%/0$04$8/,/$&$*#$*9$(-070$&0.7&5$*(*6-/8*9#*&$$.%*-$#//0&75$&/0-/$&%*-$#)S)P!A-.6*8$-*-$F;J9#*&$)S)Q!N$-.*(F;J9#*&$)S)S!37$($F;J9#*&$)S)U!O&/718.#/&$)