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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２０５１—２００８食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法 实时犘犆犚法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犫狅狏犻狀犲，狅狏犻狀犲，狆狅狉犮犻狀犲犱犲狉犻狏犲犱犿犪狋犲狉犻犪犾狊犻狀犳狅狅犱，犮狅狊犿犲狋犻犮犪狀犱犳犲犲犱—犚犲犪犾狋犻犿犲犘犆犚犿犲狋犺狅犱２００８０４２９发布２００８１１０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言本标准的附录Ｆ为规范性附录，附录Ａ、附录Ｂ、附录Ｃ、附录Ｄ、附录Ｅ为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、宝生物工程（大连）有限公司、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：曹际娟、李晶泉、郑秋月、于爱丽、陈颖、姚珊、谢琰。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜２０５１—２００８食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法 实时犘犆犚法１ 范围本标准规定了食品、化妆品和饲料中牛、羊（绵羊和山羊）、猪源性成分实时ＰＣＲ检测方法。本标准适用于食品、化妆品和饲料中牛、羊（绵羊和山羊）、猪源性成分的鉴别检测。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法（ＧＢ／Ｔ６６８２—１９９２，ｎｅｑＩＳＯ３６９６：１９８７）ＧＢ１９４８９ 实验室 生物安全通用要求３ 术语和定义、缩略语下列术语和定义、缩略语适用于本标准。３．１ 术语和定义３．１．１牛源性成分 犫狅狏犻狀犲犱犲狉犻狏犲犱犿犪狋犲狉犻犪犾狊牛种属特异性ＤＮＡ片段。３．１．２羊源性成分 狅狏犻狀犲犱犲狉犻狏犲犱犿犪狋犲狉犻犪犾狊羊种属特异性ＤＮＡ片段。３．１．３猪源性成分 狆狅狉犮犻狀犲犱犲狉犻狏犲犱犿犪狋犲狉犻犪犾狊猪种属特异性ＤＮＡ片段。３．１．４实时荧光犘犆犚 狉犲犪犾狋犻犿犲犳犾狌狅狉犲狊犮犲狀狋犘犆犚实时荧光聚合酶链式反应。３．１．５犆狋值 犆狔犮犾犲狋犺狉犲狊犺狅犾犱犆狋每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。３．２ 缩略语３．２．１犇犖犃 犱犲狅狓狔狉犻犫狅狀狌犾犲犻犮犪犮犻犱脱氧核糖核酸。３．２．２犘犆犚 狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀聚合酶链式反应。１犛犖／犜２０５１—２００８３．２．３犜犪狇 犜犺犲狉犿狌狊犪狇狌犪狋犻犮狌水生栖热菌。３．２．４犉犃犕 ６犮犪狉犫狅狓狔犳犾狌狅狉犲狊犮犲犻狀６羧基荧光素。３．２．５犚犗犡 ５犮犪狉犫狅狓狔犡狉犺狅犱犪犿犻狀犲６羧基Ｘ罗丹明。３．２．６犎犈犡 ５犺犲狓犪犮犺犾狅狉狅犳犾狌狅狉犲狊犮犲犻狀６羧基２′，４，４′，５′，７，７′六氯荧光素。３．２．７犆犗犡Ⅰ 犆狔狋狅犮犺狉狅犿犲犆狅狓犻犱犪狊犲狊狌犫狌狀犻狋Ⅰ细胞色素Ｃ氧化酶亚单位Ⅰ。４ 原理本标准采用ＴａｑＭａｎ实时荧光ＰＣＲ技术，根据线粒体ＤＮＡ（ＣＯＸⅠ）基因上动物种间多态性的差异而进行动物源性种类鉴定。本标准应用多色荧光检测技术，采用多重ＰＣＲ方法。牛、羊、猪源性成分单体系检测时，对反应液中含有的两种不同荧光染料进行双通道同步检测，在同一反应管内对牛或羊或猪的ＣＯＸⅠ基因及内参照反应同时进行扩增，并通过标记两种不同荧光物质（ＦＡＭ、ＨＥＸ）的特异性探针进行特异性杂交，两色荧光同步检测；牛羊源性成分混合体系检测时，对反应液中含有的三种不同荧光染料进行三通道同步检测，在同一反应管内分别对牛、羊特异的ＣＯＸⅠ基因及内参照（ＩｎｔｅｒｎａｌＣｏｎｔｒｏｌ）同时进行扩增，并通过标记三种不同荧光物质（ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＲＯＸ）的特异性探针进行特异性杂交，多色荧光同步检测。其中，对内参照反应的检测，可以监控反应是否正常进行，防止假阴性结果。５ 材料与试剂５．１ 设备和材料５．１．１ 实时荧光ＰＣＲ检测系统。５．１．２ 高速台式冷冻离心机（最高转速１２０００ｒ／ｍｉｎ以上）。５．１．３ 台式离心机（最高转速２０００ｒ／ｍｉｎ）。５．１．４ 振荡器。５．１．５ 冰箱（２℃～８℃和－２０℃或－８０℃）。５．１．６ 微量可调移液器及配套吸头（１０μＬ、１００μＬ、１０００μＬ）。５．１．７ 实时荧光ＰＣＲ反应管。５．１．８ 离心管。５．１．９ 水浴槽。５．１．１０ 加热器。５．１．１１ 可移动紫外灯。５．１．１２ 磁力架。５．２ 试剂除特别说明以外，所用试剂均为分析纯，水为按照ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。所有试剂均用无ＤＮＡ酶污染的容器分装。２犛犖／犜２０５１—２００８５．２．１ 基因组ＤＮＡ提取试剂盒１）：组成、功能及使用注意事项参见附录Ａ。５．２．２ 牛源性成分实时荧光ＰＣＲ检测试剂盒１）：组成、功能及使用注意事项参见附录Ｂ。５．２．３ 羊源性成分实时荧光ＰＣＲ检测试剂盒１）：组成、功能及使用注意事项参见附录Ｃ。５．２．４ 猪源性成分实时荧光ＰＣＲ检测试剂盒１）：组成、功能及使用注意事项参见附录Ｄ。５．２．５ 牛羊源性成分实时荧光ＰＣＲ检测试剂盒１）：组成、功能及使用注意事项参见附录Ｅ。６ 抽样６．１ 采样工具下列采样工具应经１８０℃±２℃，２ｈ高温灭菌：剪刀、镊子、扦子。６．２ 样品采集待检样品装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，送实验室。６．３ 样品储运样品采集后，将采集的样品放入密闭的塑料袋内（一个采样点的样品放入一个塑料袋），于保温箱中加冰、密封，送实验室。７ 操作方法７．１ 实验室的设备和管理实验室的设备与管理见附录Ｆ。７．２ 样品模板犇犖犃的制备７．２．１ 在样本制备区进行。组成、功能及使用注意事项参见附录Ａ。７．２．２ 固态食品和饲料中基因组ＤＮＡ的提取试剂盒参见附录Ａ中的第Ａ．１章固态食品和饲料中基因组ＤＮＡ提取试剂盒处理样品。７．２．３ 液态食品和化妆品中基因组ＤＮＡ的提取试剂盒参见附录Ａ中的第Ａ．２章液态食品和化妆品中基因组ＤＮＡ提取试剂盒处理样品。模板ＤＮＡ溶液放于冰上保存备用。若长期保存须存放于－２０℃或－８０℃冰箱。７．３ 检测７．３．１ 扩增试剂准备在反应混合物配制区进行。为确保检测结果的准确性，在进行实际样品检测时，应设立空白对照、阴性对照和阳性对照实验。实时荧光ＰＣＲ反应体系见表１。从牛、羊、猪、牛羊源性成分实时荧光ＰＣＲ检测试剂盒（分别参见附录Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）中取出相应的实时荧光ＰＣＲ反应用试剂，融化后，２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｓ。向每个实时荧光ＰＣＲ反应管中各分装２４μＬ反应混合液（除模板ＤＮＡ外），转移至上样区。表１ 实时荧光犘犆犚反应体系试 剂 成 分体 积２×预混液１２．５μＬ引物混合液１μＬ探针混合液１μＬ样品ＤＮＡ（１ｎｇ／μＬ～１００ｎｇ／μＬ）１μＬ（ｄｄＨ２Ｏ）至２５μＬ 注１：空白对照实验时，用ｄｄＨ２Ｏ替代样品ＤＮＡ。注２：阴性对照实验时，用非目标源性成分替代样品ＤＮＡ。注３：阳性对照实验时，用相应的牛或羊或猪或牛羊混合ＤＮＡ替代样品ＤＮＡ。 １） 由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。３犛犖／犜２０５１—２００８７．３．２ 加样在上样区进行。在各设定的实时荧光ＰＣＲ反应管中分别加入制备的模板ＤＮＡ溶液，盖紧管，离心５ｓ～１０ｓ。７．３．３ 实时荧光犘犆犚检测在检测区进行。将本标准７．３．２中离心后的实时荧光ＰＣＲ反应管放入实时荧光ＰＣＲ检测系统内，记录样本摆放顺序。循环条件设置：９５℃／１０ｓ，１个循环；９５℃／５ｓ，６０℃／２０ｓ（２４ｓ、３０ｓ、３１ｓ、３４ｓ）２），４０个循环，在每次循环的退火时收集荧光。检测结束后，根据扩增曲线和Ｃｔ值判定结果。８ 结果判定８．１ 结果分析条件设定直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整。８．２ 质控标准８．２．１ 牛、羊、猪源性成分单体系检测阴性对照：有ＨＥＸ荧光信号检出，并出现典型的扩增曲线，Ｃｔ值应小于２８．０，而无ＦＡＭ荧光信号检出。８．２．２ 牛、羊源性成分混合体系检测阴性对照：有ＨＥＸ荧光信号检出，并出现典型的扩增曲线，Ｃｔ值应小于２８．０，而无ＦＡＭ和ＲＯＸ荧光信号检出。８．２．３ 牛、羊、猪源性成分单体系检测阳性对照：有ＦＡＭ和ＨＥＸ荧光信号检出，并出现典型的扩增曲线，Ｃｔ值应小于２８．０。８．２．４ 牛、羊源性成分混合体系检测阳性对照：有ＦＡＭ、ＲＯＸ和ＨＥＸ荧光信号检出，并出现典型的扩增曲线，Ｃｔ值应小于２８．０。８．３ 结果判定与表述８．３．１ 有效原则Ｃｔ值小于等于３５视为有效值，Ｃｔ值大于３５视为无效值。８．３．２ 结果的判定８．３．２．１ 当使用附录Ｂ、Ｃ、Ｄ对牛、羊、猪源性成分单体系检测时，实验结果的判定情况说明见表２。表２ 对牛、羊、猪单体系检测时结果的判定情况ＦＡＭ荧光ＨＥＸ荧光结果判定情况＋－（＋） 如果同时进行的阴性对照实验结果正常，检测实际样品时，不管ＨＥＸ荧光信号是否检出（如果检测样品浓度高会抑制内参照ＤＮＡ的扩增），如果有ＦＡＭ荧光检出，且Ｃｔ值小于等于３５，判定为含有牛、羊、猪源性成分；如果Ｃｔ值大于３５，可视为不含有牛、羊、猪源性成分。－＋ 如果同时进行的阳性对照实验结果正常，检测实际样品时有ＨＥＸ荧光检出，无ＦＡＭ荧光检出，判定为不含有牛、羊、猪源性成分。－－ ＰＣＲ反应失败。注意以下方面后再次进行反应： ａ） 如果同时进行的阳性对照实验结果正常，则可能是样品ＤＮＡ制备有问题，如样品中可能存在ＰＣＲ反应的抑制物等； ｂ） 如果同时进行的阳性对照实验结果不正常，则可能是实验操作失败或试剂失活。８．３．２．２ 当使用附录Ｅ对牛、羊源性成分混合体系检测时，实验结果的判定情况说明见表３。 ２） 使用ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ扩增仪时应根据仪器型号设定不同时间。７７００／７９００ＨＴ设定为３０ｓ，７０００／７３００设定为３１ｓ，７５００设定为３４ｓ，７５００Ｆａｓｔ设定为２４ｓ。４犛犖／犜２０５１—２００８表３ 对牛、羊混合体系同时检测时结果的判定情况ＦＡＭ荧光ＲＯＸ荧光ＨＥＸ荧光结果判定情况＋－－＋＋＋－（＋） 如果同时进行的阴性对照实验结果正常，检测实际样品时，不管ＨＥＸ荧光信号是否检出（如果检测样品浓度高会抑制内参照ＤＮＡ的扩增），如果有ＦＡＭ荧光检出，且Ｃｔ值小于等于３５，判定为含有牛源性成分；如果Ｃｔ值大于３５，可视为不含有牛源性成分。无ＲＯＸ荧光检出，判定为不含有羊源性成分。 如果同时进行的阴性对照实验结果正常，检测实际样品时，不管ＨＥＸ荧光信号是否检出（如果检测样品浓度高会抑制内参照ＤＮＡ的扩增），如果有ＲＯＸ荧光检出，且Ｃｔ值小于等于３５，判定为含有羊源性成分；如果Ｃｔ值大于３５，可视为不含有羊源性成分。无ＦＡＭ荧光检出，判定为不含有牛源性成分。 如果同时进行的阴性对照实验结果正常，检测实际样品时，不管ＨＥＸ荧光信号是否检出（如果检测样品浓度高会抑制内参照ＤＮＡ的扩增），如果有ＦＡＭ和ＲＯＸ荧光同时检出，且Ｃｔ值小于等于３５，判定为即含有牛源性成分又含有羊源性成分；如果ＦＡＭ通道Ｃｔ值大于３５，可视为不含有牛源性成分；如果ＲＯＸ通道Ｃｔ值大于３５，可视为不含有羊源性成分。－－＋ 如果同时进行的阳性对照实验结果正常，检测实际样品时有ＨＥＸ荧光检出，无ＦＡＭ荧光检出，判定为不含有牛源性成分；无ＲＯＸ荧光检出，判定为不含有羊源性成分。－－－ ＰＣＲ反应失败。注意以下方面后再次进行反应： ａ） 如果同时进行的阳性对照实验结果正常，则可能是样品ＤＮＡ制备有问题，如样品中可能存在ＰＣＲ反应的抑制物等； ｂ） 如果同时进行的阳性对照实验结果不正常，则可能是实验操作失败或试剂失活。８．３．３ 结果的表述结果陈述为“检出牛、羊、猪源性成分。”和“未检出牛、羊、猪源