书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准!!#!#$!%地中海实蝇检疫鉴定方法$%&法’()*+,-,./+,0*0-1)(,+)22/*)/*-23,+-45!!#$%&%&’($)&%$%$6,)()7/**#$%&820+0.04!%9&!9!’发布!(9%9&实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前!!言!!本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口!本标准起草单位中华人民共和国深圳出入境检验检疫局#中华人民共和国广东出入境检验检疫局!本标准主要起草人杨伟东#余道坚#胡学难#康林#陈枝楠#仲建忠#章桂明#徐浪!本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准!!!!#!#$!%地中海实蝇检疫鉴定方法$%&法&!范围本标准规定了地中海实蝇常规!#和$%’())*实时荧光!#鉴定方法!本标准适用于进境水果#茄科蔬菜$包括番茄#茄子和辣椒等%及包装物#土壤等的检验检疫中对地中海实蝇卵#幼虫#蛹和成虫的种类鉴定!!!规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款!凡是注明日期的引用文件&其随后所有的修改单$不包括勘误的内容%或修订版均不适用于本标准&然而&鼓励根据标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本!凡是不注明日期的引用文件&其最新版本适用于本标准!’&’+,,-.!分析实验室用水规格和试验方法$*)/0$12,3,%#!缩略语下列缩略语适用于本标准!#4&!’($%&!!)*&+,--.,-/0(123-$%&$%’())*实时荧光!#!#4!4#$!4-567,285.9:0-5;24-1,2=5;=/1-脱氧核苷三磷酸!#4#%?!3-012.+:9,@-/./07;2;溶解曲线分析!#4’!#酶栖热水生菌567聚合酶!#4(%AB!:715:=,53-5624/;-B细胞色素氧化酶0亚基!#4)%1!1=,-;=504:7:0-循环阈值!’!原理实蝇样本$卵#幼虫#蛹或成虫%经过提取总基因组567后&利用设计的特异性引物&通过常规!#和$%’())*实时荧光!#$$’8!#%技术&特异性扩增地中海实蝇9:56710基因片段$2;2=%&根据!#扩增结果$常规!#通过产物凝胶电泳结果($’8!#通过扩增曲线和溶解曲线%&!!#!#$!%判定实蝇标本的种类是否是地中海实蝇!特异性引物是通过比对地中海实蝇与腊实蝇属中的纳塔尔实蝇#非洲芒果实蝇&按实蝇属中的加勒比按实蝇#墨西哥按实蝇&以及绝大多数果实蝇的9:56710基因片段设计出来的!(!仪器(4&!!#扩增仪!(4!!实时荧光!#仪!(4#!电泳仪!(4’!紫外分光光度计!(4(!凝胶成像系统!(4)!低温冰箱!(4%!冷藏冷冻冰箱!(4*!水浴锅!(4$!离心机!(4&!电子天平!(4&&!微量加样器$?4@A#.A#?A#.?A#??A#.??A#???A%!)!试剂)4&!实验用水$应符合’&’+,,-.中一级水的规格%!)4!!蛋白酶B$.?9C’9A%!)4#!#67消化酶!)4’!D5+7$?4@9EF’A&=G-4?%!)4(!+D$=G-4?%!)4)!?HAEIJK*C&LMM)($电泳上样缓冲液%!)4%!AIJJ)(567NI(O)(!)4*!琼脂糖!)4$!567染色剂!)4&!昆虫基因组567提取试剂盒!)4&&!567快速纯化’回收试剂盒!)4&!!P?Q和33433Q乙醇!)4!酚#三氯甲烷#异丙醇#异戊醇等有机试剂&有机试剂如未有特殊说明&均为分析醇!)4&’!!#试剂盒)包括?H!#缓冲液#NC.R$.@99EF’A%#J6+!$.4@99EF’A%*!)4&(!!#酶!)4&)!.H$%’())*NIS:)(NKT!)4&%!引物$?=9EF’A%!%!检测方法%4&!实蝇标本的前处理用于分子生物学试验的实蝇样本使用前应长期冷藏在U;V冰箱!所有实蝇标本在567提取之前均要作前处理&卵#幼虫#蛹#成虫或部分组织等实蝇样本要用无菌水冲洗数遍&晾干(干标本#乙醇和福尔马林浸泡的标本先用+D$=G-4?%浸泡处理W#.W!.!!#!#$!%%C!!实蝇基因组D?提取%C!C&!试剂盒法将实蝇样本移入4@9A离心管或碾钵中&捣碎或加入液氮碾磨&之后实验步骤根据试剂盒的操作说明书操作!实蝇基因组567溶液置U.?V冷冻保存!%4!4!!酚8三氯甲烷法将单头实蝇样本移入4@9A离心管或碾钵中&捣碎或加入液氮碾磨!加入567裂解缓冲液2??A和蛋白酶B.?A$.??C’9A%&,@V水浴W#2W或过夜(加等体积的酚X三氯甲烷X异戊醇$.@X.;X%&轻轻颠倒混匀.次&-???(’9K*离心@9K*&小心吸取上清液(加入等体积的三氯甲烷8异戊醇$.;X%&混匀&-???(’9K*离心@9K*&小心吸取上清液(重复此步骤次#.次&直到在界面上看不到蛋白质(加入.倍体积的无水乙醇或异丙醇&混匀&室温或U.?V沉淀?4@W#2W$也可沉淀过夜%&2???(’9K*离心@9K*#2?9K*&弃上清液(P?Q或P@Q的乙醇洗涤沉淀.次#2次&-???(’9K*适度离心.9K*&弃上清液(沉淀干燥后加入@?A#.??A+D或去离子水溶解&U.?V低温保存!%C#!D?质量检查实蝇基因组567的纯度和浓度检测方法通过紫外分光光度计测定567溶液的$%值&567纯度Y$%.,?’$%.-?$4,$%.,?’$%.-?.4?&比值低于4,或高于.4?都认为模板纯度不够&前者不能满足!#扩增时对模板的纯度要求&需用567快速纯化’回收试剂盒纯化(后者模板中含有#67&必要时要用#67酶消化%(双链567浓度Y$%.-?H567母液稀释倍数H@?*C’A!%C’!常规$%&扩增反应%C’C&!引物地中海实蝇常规!#扩增引物序列见表!表&!引物序列类!型名!称序!列扩增片段长度’=正向引物78108A@Z8+++7’7+7++7++7+’++’++82Z反向引物78108#@Z87++’7’++’7’77777’’82Z2;2%4’4!!反应体系反应体系见表.!表!!常规$%&反应体系试剂名称!#反应体系终浓度?H!#缓冲液$不含NC.R%H!#缓冲液NCF.溶液.99EF’AJ6+!?4.99EF’A正向引物和反向引物各?4.9EF’A!#酶[567模板.?*C#;?*C双蒸水补足反应总体积到.@A!!注反应体系中各试剂的量可根据反应体系的总体积进行适当调整!2!!#!#$!%%4’4#!反应条件3;V’@9K*&3@V’;?S&@;V’2?S&P.V’2?S&.@个循环&P.V延伸@9K*!%4’4’!阴性对照#阳性对照和空白对照的设置阴性对照以实蝇科其他实蝇种类$如桔小实蝇%567为模板(阳性对照以已知是地中海实蝇的567或含有待测基因序列的质粒为!#模板(空白对照以水代替567模板!%4(!!)*&(’,--.实时荧光$%&%C(C&!引物引物序列同P4;4!%4(4!!反应体系$%’())*实时荧光!#反应体系见表2!表#!!’($%&反应体系试剂名称加入!#反应体系的体积’A.H$%’())*NIS:)(NKT?A正向引物和反向引物各?4@A567模板A$.?*C#;?*C%双蒸水-A反应总体积.?A!!注反应体系中各试剂的量可根据反应体系的总体积进行适当调整!%4(4#!反应条件!!@?V’.9K*(3@V’?9K*(3@V’@S(,?V’9K*(;?个循环!%4(4’!阴性对照#阳性对照和空白对照的设置同P4;4;!%C)!$%&扩增产物的检测%C)C&!凝胶电泳检测常规!#产物用琼脂糖凝胶电泳检查扩增目标片段的大小!取!#产物@A&加入上样缓冲液A&并用5A.???AIJJ)(567NI(O)(作分子量标记&在含567染色剂的4@Q琼脂糖凝胶上电泳2?9K*$3?\%&凝胶图像分析仪上检查是否扩增出预期大小的目标片段&拍摄并记录结果!%4)4!!!’($%&检测%C)C!C&!!)*&’,--.实时荧光$%&扩增曲线$’8!#反应中&!#扩增中收集到的荧光数据由计算机软件自动生成扩增曲线&即$&’对循环数的曲线图&当样品的荧光值与仪器内标#1]染料之差$$&’%超过设定的阈值则认为是阳性反应&(:值是指荧光值开始达到指数增长时的循环数!%4)4!4!!溶解曲线分析$’8!#产物的特异性可用溶解曲线分析来确定&实时荧光!#反应结束后&直接实时荧光!#仪上再运行N)F:K*CIFFKIS程序进行溶解曲线分析&程序的反应步骤3@V’@S(,?V’.?S&在39K*@3S内温度上升至3@V并维持@S!;!!#!#$!%*!结果判定*C&!常规$%&检测琼脂糖凝胶电泳结果待测样品与阳性对照扩增出一条大小为2;2=的特异性567产物带&阴性对照与空白对照无567产物带!上述实验做.个或.个以上重复&结果一致则可判定样品的种类为地中海实蝇!*C!!!’($%&检测待测样品和阳性对照(:值小于等于2?&有典型的扩增曲线&溶解曲线有明显的溶解温度(阴性对照和空白对照无(:值或(:大于2@&无扩增曲线&溶解曲线无明显的溶解温度!上述实验做.个或.个以上重复&结果一致则可判定样品的种类为地中海实蝇!(:大于2?的样品建议调整模板浓度后重做&重做结果无(:值&无扩增曲线&溶解曲线无明显的溶解温度&可判定样品不是地中海实蝇!@!!#!#$!%书书书!#!$%#!#中华人民共和国出入境检验检疫行!业!标!准地中海实蝇检疫鉴定方法$%&法!!#$%&’$%%(中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街)*号邮政编码#)%%%+,网址---./01.234.12电话#*5,$&’+*!*5,)(,+5中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本55%6)$&%)!)*!印张%.(,!字数)%千字$%%5年&月第一版!$%%5年&月第一次印刷印数)$%%%书号#),,%**$$7)5,)&!定价&.元