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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１８６９—２００７食品中多种致病菌快速检测方法犘犆犚法犚犪狆犻犱犱犲狋犲犮狋犻狅狀犿犲狋犺狅犱狊犳狅狉狆犪狋犺狅犵犲狀狊犻狀犳狅狅犱狊—犘犆犚犿犲狋犺狅犱２００７０４０６发布２００７１０１６实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准食品中多种致病菌快速检测方法犘犆犚法ＳＮ／Ｔ１８６９—２００７中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张１ 字数２５千字２００７年６月第一版 ２００７年６月第一次印刷印数１—２０００书号：１５５０６６·２１７７９８ 定价１０．００元食品伙伴网书书书前 言 本标准的附录Ａ是规范性附录，附录Ｂ、附录Ｃ和附录Ｄ是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国汕头出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、中国合格评定国家认可委员会、大连产品质量检验所、中华人民共和国青岛出入境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局、深圳太太基因工程有限公司。本标准起草人：卢行安、许业莉、曹际娟、李苏龙、谢昭聪、朱海、李宏、郑卫平、秦成、王刚、刘艳泓、雷质文、刘中学、施伟良、孙杰、刘冉、郑秋月、段莹、张经纬、肖性龙。本标准系首次发布的检验检疫行业标准。Ⅰ犛犖／犜１８６９—２００７食品伙伴网食品中多种致病菌快速检测方法犘犆犚法１ 范围本标准规定了用普通ＰＣＲ技术快速检测食品中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌Ｏ１５７∶Ｈ７、副溶血性弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌的方法；用ＢＡＸ?全自动致病菌ＰＣＲ检测系统１）检测食品中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌Ｏ１５７∶Ｈ７和阪崎肠杆菌的方法。１）为美国杜邦公司（ＤｕＰｏｎｔＱｕａｌｉｃｏｎ）的产品。本标准适用于食品中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌Ｏ１５７∶Ｈ７、副溶血性弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌的检验。２ 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。ＧＢ／Ｔ４７８９．４ 食品微生物学检验 沙门氏菌检验ＧＢ／Ｔ４７８９．５ 食品微生物学检验 志贺氏菌检验ＣＢ／Ｔ４７８９．６ 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验ＧＢ／Ｔ４７８９．７ 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验ＧＢ／Ｔ４７８９．８ 食品微生物学检验 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验ＧＢ／Ｔ４７８９．９ 食品微生物学检验 空肠弯曲菌检验ＧＢ／Ｔ４７８９．１０ 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验ＧＢ／Ｔ４７８９．３０ 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法ＧＢ１９４８９ 实验室 生物安全通用要求ＳＮ０１７０ 出口食品中沙门氏菌检验方法ＳＮ０１７２ 出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法ＳＮ０１７３ 出口食品副溶血性弧菌检验方法ＳＮ０１７４ 出口食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌检验方法ＳＮ０１７５ 出口食品中空肠弯曲菌检验方法ＳＮ０１８４ 出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法ＳＮ／Ｔ０９７３ 进出口肉及肉制品中肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７检验方法ＳＮ／Ｔ１０２２ 出口食品中霍乱弧菌检验方法ＷＳ／Ｔ２３０ 临床诊断中聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术的应用ＩＳＯ６５７９ 微生物学———沙门氏菌检验方法指南ＩＳＯ１１２９０１ 食品和动物饲料微生物学———单核细胞增生李斯特氏菌定性和定量检测方法 第１部分：定性检测方法１犛犖／犜１８６９—２００７食品伙伴网ＩＳＯ１６６５４ 食品和动物饲料微生物学—大肠杆菌Ｏ１５７检测方法ＮＭＫＬＮｏ．１５６ 北欧食品协会 食品中致病性弧菌定性和定量检测方法ＦＤＡ／ＢＡＭＣｈａｐｔｅｒ５ 美国食品药品管理局 微生物学分析手册 第２章沙门氏菌ＦＤＡ／ＢＡＭＣｈａｐｔｅｒ９ 美国食品药品管理局 微生物学分析手册 第９章弧菌ＦＤＡ／ＢＡＭＣｈａｐｔｅｒ１０ 美国食品药品管理局 微生物学分析手册 食品中单核细胞增生李斯特氏菌定性和定量检测方法ＵＳＤＡ／ＦＳＩＳＭＬＧ４Ｃ．０１ 美国农业部食品安全检验局 生肉、畜胴体擦拭样品、整鸡淋洗液、即食食品、禽肉制品和巴氏蛋制品中沙门氏菌ＢＡＸＰＣＲ筛选方法ＵＳＤＡ／ＰＳＩＳＭＬＧ８Ａ．０１ 美国农业部食品安全检验局 单核细胞增生李斯特氏菌ＢＡＸ筛选方法３ 缩略语下列缩略语适合于本标准。３．１犘犆犚 狆狅犾狔犿犲狉犪狊犲犮犺犪犻狀狉犲犪犮狋犻狅狀聚合酶链反应，简称ＰＣＲ。３．２犱犖犜犘 犱犲狅狓狔狉犻犫狅狀狌犮犾犲狅狊犻犱犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧核苷三磷酸。３．３犱犃犜犘 犱犲狅狓狔犪犱犲狀狅狊犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧腺苷三磷酸。３．４犱犌犜犘 犱犲狅狓狔犵狌犪狀狅狊犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧鸟苷三磷酸。３．５犱犆犜犘 犱犲狅狓狔犮狔狋犻犱犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧胞苷三磷酸。３．６犱犜犜犘 犱犲狅狓狔狋犺狔犿犻犱犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧胸苷三磷酸。３．７犱犝犜犘 犱犲狅狓狔狌狉犻犱犻狀犲狋狉犻狆犺狅狊狆犺犪狋犲脱氧尿苷三磷酸。３．８犛犇犛 狊狅犱犻狌犿犱狅犱犲犮狔犾狊狌犾犳犪狋犲十二烷基硫酸钠。３．９犜狉犻狊 狋狉犻狊（犺狔犱狉狅狓狔犿犲狋犺狔犾）犪犿犻狀狅犿犲狋犺犪狀犲三（羟甲基）氨基甲烷。３．１０犇犈犘犆焦碳酸乙二酯。２犛犖／犜１８６９—２００７食品伙伴网３．１１犜犪狇酶犜犪狇ＤＮＡ聚合酶。３．１２犝犖犌酶ｕｒａｃｉｌＤＮＡｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ尿嘧啶ＤＮＡ糖基酶。４ 生物安全措施为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测沙门氏菌，所有培养物和废弃物应小心处置。并按ＧＢ１９４８９中的有关规定执行。５ 防污染措施参照标准《临床诊断中聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术的应用》（ＷＳ／Ｔ２３０）中第６章污染的预防和控制。６ 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。６．１ 水：应符合ＧＢ／Ｔ６６８２中一级水的规格。６．２ ＤＮＡ提取液：主要成分是ＳＤＳ，Ｔｒｉｓ，ＥＤＴＡ。６．３ １０×ＰＣＲ缓冲液［其中氯化钾（ＫＣｌ）：５００ｍｍｏｌ／Ｌ；ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．３）：１００ｍｍｏｌ／Ｌ；明胶：０．１％］。６．４ ＰＣＲ反应液：含氯化镁（ＭｇＣｌ２）的ＰＣＲ缓冲液、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、犜犪狇酶、ＵＮＧ酶。２）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。６．５ 琼脂糖。６．６ １０×上样缓冲液：含０．２５％溴酚蓝，０．２５％二甲苯青ＦＦ，３０％甘油水溶液。６．７ ５０×ＴＡＥ缓冲液：称取４８４ｇＴｒｉｓ，量取１１４．２ｍＬ冰醋酸，２００ｍＬ０．５ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（ｐＨ：８．０），溶于水中，定容至２Ｌ。分装后高压灭菌备用。６．８ ＤＮＡ分子量标记物（１００ｂｐ～１０００ｂｐ）。６．９ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管和ＰＣＲ反应管。６．１０ ｍＬＳＴＶｍ肉汤：阪崎肠杆菌检测用，参见附录第Ｄ．１章。６．１１ ＢＨＩ肉汤：阪崎肠杆菌检测用，参见附录第Ｄ．２章。６．１２ 常见致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、空肠弯曲菌、肠出血性大肠埃希氏菌Ｏ１５７∶Ｈ７、副溶血性弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌）普通ＰＣＲ检测试剂盒２）（试剂盒组成、功能及使用注意事项参见附录Ｂ）。６．１３ ＢＡＸ?沙门氏菌的ＰＣＲ检测试剂盒（Ｑｕａｌｉｃｏｎ＃１７７１０６０８，试剂盒组成参见附录Ｃ），５℃±３℃放置。６．１４ ＢＡＸ?单核细胞增生李斯特氏菌ＰＣＲ检测试剂盒（Ｑｕａｌｉｃｏｎ＃１７７１０６０９），５℃±３℃放置。６．１５ ＢＡＸ?弯曲菌的ＰＣＲ检测试剂盒（Ｑｕａｌｉｃｏｎ＃１７７２０６８０），５℃±３℃放置。６．１６ ＢＡＸ?系统肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７多重（ＭＰ）ＰＣＲ筛选试剂盒（Ｑｕａｌｉｃｏｎ＃１７７２０６７３）。６．１７ ＢＡＸ?系统肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７∶Ｈ７（ＭＰ）ＰＣＲ快速检测增菌培养基（Ｑｕａｌｉｃｏｎ＃１７７１０６７８，１７７１０６７９）。３犛犖／犜１８６９—２００７食品伙伴网６．１８ ＢＡＸ?阪崎肠杆菌的ＰＣＲ检测试剂盒（Ｑｕａｌｉｃｏｎ＃１７７２０６５７），５℃±３℃放置。７ 仪器和设备７．１ ＰＣＲ仪。７．２ 电泳装置。７．３ 凝胶分析成像系统。７．４ ＰＣＲ超净工作台。７．５ 高速台式离心机（离心转速１２０００ｒ／ｍｉｎ以上），台式离心机（离心转速２０００ｒ／ｍｉｎ）。７．６ 微量可调移液器（２μＬ、１０μＬ、１００μＬ、１０００μＬ）。７．７ ＢＡＸ?全自动致病菌检测系统（启动包）。第一法 普通犘犆犚法８ 检测程序普通ＰＣＲ方法检测程序见图１。图１ 犘犆犚检测致病菌程序图９ 操作步骤９．１ 样品制备、增菌培养和分离９．１．１ 沙门氏菌按照ＧＢ／Ｔ４７８９．４或ＳＮ０１７０或ＩＳＯ６５７９或ＦＤＡ／ＢＡＭＣｈａｐｔｅｒ５或ＵＳＤＡ／ＦＳＩＳＭＬＧ４Ｃ．０１方法进行。９．１．２ 志贺氏菌按照ＧＢ／Ｔ４７８９．５方法进行。９．１．３ 金黄色葡萄球菌可按照ＧＢ／Ｔ４７８９．１０或ＳＮ０１７２方法进行。９．１．４ 小肠结肠炎耶尔森氏菌可按照ＧＢ／Ｔ４７８９．８或ＳＮ０１７４方法。４犛犖／犜１８６９—２００７食品伙伴网９．１．５ 单核细胞增生李斯特氏菌可按照ＧＢ／Ｔ４７８９．３０或ＳＮ０１８４或ＩＳＯ１１２９０或ＦＤＡ／ＢＡＭＣｈａｐｔｅｒ１０或ＵＳＤＡ／ＦＳＩＳＭＬＧ８Ａ．０１方法进行。９．１．６ 空肠弯曲菌按照ＧＢ／Ｔ４７８９．９或ＳＮ０１７５方法进行。９．１．７ 肠出血性大肠埃希氏菌Ｏ１５７∶Ｈ７按照ＧＢ／Ｔ４７８９．６或ＳＮ／Ｔ０９７３或ＩＳＯ１６６５４方法进行。９．１．８ 副溶血性弧菌按照ＧＢ／Ｔ４７８９．７或ＳＮ０１７３或ＦＤＡ／ＢＡＭＣｈａｐｔｅｒ９或ＮＭＫＬＮｏ．１５６方法进行。９．１．９ 霍乱弧菌按照ＳＮ／Ｔ１０２２或ＦＤＡ／ＢＡＭＣｈａｐｔｅｒ９或ＮＭＫＬＮｏ．１５６方法进行。９．１．１０ 创伤弧菌按照ＦＤＡ／ＢＡＭＣｈａｐｔｅｒ９或ＮＭＫＬＮｏ．１５６方法进行。９．２ 细菌模板犇犖犃的提取９．２．１ 直接提取法对于上述方法培养的增菌液，可直接取该增菌液１ｍＬ加到１．５ｍＬ无菌离心管中，８０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，尽量吸弃上清；加入５０μＬＤＮＡ提取液（参见附录Ｂ），混匀后沸水浴５ｍｉｎ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清保存于－２０℃备用以待检测。－７０℃可长期保存。对于９．１方法分离到的可疑菌落，可直接挑取可疑菌落，加入５０μＬＤＮＡ提取液，再按照上述步骤制备模板ＤＮＡ以待检测。９．２．２ 有机溶剂提纯法取待测样本（增菌培养液或分离菌落菌悬液）１ｍＬ，加到１．５ｍＬ离心管中，８０００ｒ／ｍｉｎ离心４ｍｉｎ，尽量吸弃上清；加入７５０μＬＤＮＡ提取液，沸水浴５ｍｉｎ，加