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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１７５１．３—２０１１进出口动物源性食品中喹诺酮类药物残留量的测定 第３部分：高效液相色谱法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳狇狌犻狀狅犾狅狀犲狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犳狅狅犱狊狋狌犳犳狊狅犳犪狀犻犿犪犾狅狉犻犵犻狀犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋—犘犪狉狋３：犎犘犔犆犿犲狋犺狅犱２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 ＳＮ／Ｔ１７５１《进出口动物源性食品中喹诺酮类药物残留量的测定》共分为３部分：———第１部分：微生物抑制法；———第２部分：液相色谱质谱／质谱法；———第３部分：高效液相色谱法。本部分为ＳＮ／Ｔ１７５１的第３部分。本部分按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国东宁出入境检验检疫局和中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局。本部分主要起草人：于静、马微、彭涛、安娟、严矛、郝静云。Ⅰ犛犖／犜１７５１．３—２０１１进出口动物源性食品中喹诺酮类药物残留量的测定 第３部分：高效液相色谱法１ 范围ＳＮ／Ｔ１７５１的本部分规定了动物源性食品中１５种喹诺酮药物残留量的高效液相色谱测定方法。本部分适用于虾肉、鱼肉、鸡肉和奶粉中环丙沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、氟甲喹、诺氟沙星、二氟沙星、麻保沙星、喹酸、萘啶酸、培氟沙星、司帕沙星、奥比沙星、氟罗沙星和洛美沙星残留量的测定。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 方法提要用磷酸盐缓冲液和乙腈提取试样中残留的喹诺酮药物，经正己烷去除油脂、Ｃ１８和ＭＡＸ固相萃取柱净化后，采用高效液相色谱荧光检测器和紫外检测器检测，外标法定量。４ 试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为去离子水或ＧＢ／Ｔ６６８２规定的一级水。４．１ 乙腈：色谱纯。４．２ 甲醇：色谱纯。４．３ 正己烷：色谱纯。４．４ 十二水合磷酸钠。４．５ 氢氧化钠。４．６ 磷酸。４．７ ２５％氨水。４．８ 甲酸。４．９ 乙腈饱和正己烷溶液：１００ｍＬ乙腈（４．１）中加入１００ｍＬ正己烷（４．３），充分振荡后，静置分层，取上层液体。４．１０ ０．０２ｍｏｌ／Ｌ磷酸溶液：准确量取１．４ｍＬ磷酸（４．６）于１Ｌ容量瓶中，用水定容至１Ｌ。４．１１ ５ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液：称取２００ｇ氢氧化钠（４．５），用水溶解并定容至１Ｌ。４．１２ 磷酸钠缓冲溶液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．４±０．２）：称取１９ｇ十二水合磷酸钠（４．４），用水溶解并定容至１Ｌ，加磷酸调节ｐＨ至７．４±０．２。４．１３ 样品提取液：１８０ｍＬ磷酸盐缓冲液（４．１２）中加入２０ｍＬ乙腈。４．１４ 洗脱液１：取２５ｍＬ２５％氨水（４．７），加入７５ｍＬ甲醇（４．２）。１犛犖／犜１７５１．３—２０１１４．１５ 洗脱液２：取４ｍＬ甲酸（４．８），加入９６ｍＬ甲醇。４．１６ 定容液：０．０２ｍｏｌ／Ｌ磷酸（４．１０）＋乙腈（８０＋２０，体积比）。４．１７ 标准品：环丙沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、氟甲喹、诺氟沙星、二氟沙星、麻保沙星、喹酸、萘啶酸、培氟沙星、司帕沙星、奥比沙星、氟罗沙星和洛美沙星，纯度≥９９％。４．１８ 标准储备溶液：称取环丙沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、氟甲喹、诺氟沙星、二氟沙星、麻保沙星、喹酸、萘啶酸、培氟沙星、司帕沙星、奥比沙星和氟罗沙星的标准品（精确至０．１ｍｇ），用乙腈溶解，配制成浓度为１００μｇ／ｍＬ的标准储备溶液，－１８℃以下避光保存。４．１９ 中间混合标准溶液：根据每种药物在仪器上的响应灵敏度，确定其在混合标准溶液中的浓度。依据每种药物的混合标准液浓度及其标准储备液浓度，移取一定量的单个药物的标准储备液于１０ｍＬ容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成浓度为１０μｇ／ｍＬ的中间标准溶液，０℃～４℃避光保存。４．２０ 混合标准工作溶液：根据需要用乙腈稀释成适用浓度的标准工作溶液，－１８℃以下避光保存。４．２１ Ｃ１８固相萃取柱（含碳量１７％）：３ｍＬ，５００ｍｇ，或相当者。４．２２ ＭＡＸ阴离子交换固相萃取柱：６ｍＬ，５００ｍｇ，或相当者。４．２３ 微孔滤膜：０．２μｍ，有机相。５ 仪器和设备５．１ 液相色谱仪：配备紫外和荧光检测器。５．２ 组织捣碎机。５．３ 天平：感量为０．０００１ｇ和０．００１ｇ。５．４ ｐＨ计：±０．１。５．５ 均质器：１００００ｒ／ｍｉｎ。５．６ 振荡器。５．７ 离心机：１００００ｒ／ｍｉｎ。５．８ 氮吹仪。５．９ 涡旋混合器。５．１０ 超声波水浴。５．１１ 分液漏斗：５０ｍＬ。５．１２ 具塞离心管：聚四氟乙烯，５０ｍＬ。５．１３ 刻度试管：１０ｍＬ。６ 试样制备６．１ 虾肉、鱼肉、鸡肉样品从原始样品取出有代表性样品约５００ｇ，用组织捣碎机充分捣碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。将试样置于－１８℃以下避光保存。６．２ 奶粉样品从原始样品取出有代表性样品约５００ｇ，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。将试样置于４℃避光保存。在制样的操作过程中，应防止样品污染或发生残留物含量的变化。２犛犖／犜１７５１．３—２０１１７ 测定步骤７．１ 提取称取约２ｇ（精确至０．０１ｇ）均质后的试样于５０ｍＬ聚四氟乙烯离心管中，加入２０ｍＬ样品提取液（４．１３），振荡提取２０ｍｉｎ后，１００００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。移取上清液１０ｍＬ于５０ｍＬ分液漏斗中，３０ｍＬ乙腈饱和正己烷（４．９）分三次液液分配除脂，振荡５ｍｉｎ，静置后收集下层。７．２ 净化７．２．１ 犆１８固相萃取柱净化Ｃ１８固相萃取柱（４．２１）依次用５ｍＬ甲醇、５ｍＬ水预淋洗后，转入１０ｍＬ提取液。用５ｍＬ水进行淋洗，弃去。用５ｍＬ洗脱液１（４．１４）进行洗脱，收集洗脱液于１０ｍＬ刻度试管中。整个固相萃取净化过程控制流速不超过２ｍＬ／ｍｉｎ。洗脱液在５０℃下用氮气吹至约１ｍＬ后加入９ｍＬ磷酸盐缓冲液（４．１２），涡旋混匀１ｍｉｎ，超声波助溶１ｍｉｎ，待过ＭＡＸ固相萃取柱（４．２２）。７．２．２ 犕犃犡固相萃取柱净化ＭＡＸ固相萃取柱依次用２ｍＬ甲醇、２ｍＬ５ｍｏｌ／Ｌ的氢氧化钠溶液（４．１１）、２ｍＬ水预淋洗后，转入磷酸盐缓冲液溶解液（７．２．１）。依次用２ｍＬ２５％的氨水、２ｍＬ甲醇进行淋洗，弃去。用５ｍＬ洗脱液２（４．１５）进行洗脱，收集洗脱液于１０ｍＬ刻度试管中。整个固相萃取净化过程控制流速不超过２ｍＬ／ｍｉｎ。洗脱液在５０℃下用氮气吹干。用定容液（４．１６）定容至１ｍＬ，涡旋混匀１ｍｉｎ后，超声波助溶１ｍｉｎ，过０．２μｍ微孔滤膜（４．２３），供仪器检测。７．３ 测定７．３．１ 仪器条件７．３．１．１ 色谱柱：ＸＴｅｒｒａＭＳＣ１８柱，２５０×４．６ｍｍ，５μｍ，或相当者。７．３．１．２ 流动相：Ａ：乙腈，Ｂ：０．０２ｍｏｌ／Ｌ磷酸：梯度洗脱条件见表１。表１ 梯度洗脱条件时间ｍｉｎＡ：乙腈％Ｂ：０．０２ｍｏｌ／Ｌ磷酸％０１２８８１７１２８８２５１６８４２８２０８０４０４０６０４０．１１２８８４５１２８８７．３．１．３ 柱温：４０℃。７．３．１．４ 流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ。７．３．１．５ 进样量：１０μＬ。３犛犖／犜１７５１．３—２０１１７．３．１．６ 检测波长见表２。表２ １５种喹诺酮药物的紫外和荧光检测波长时间ｍｉｎ紫外波长ｎｍ激发波长ｎｍ发射波长ｎｍ检测药物０～１６２９４５１４麻保沙星１６～３２２８０４５０氟罗沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、奥比沙星、沙拉沙星、二氟沙星２８０司帕沙星３２～３６２６０３８０喹酸３６～４０３１８３６８萘啶酸、培氟沙星７．３．２ 液相色谱测定根据样液中待测喹诺酮药物的含量，选定浓度相近的标准工作溶液，待测样液中喹诺酮药物的响应值应在仪器检测的线性范围内（０．４ｎｇ／ｍＬ～５μｇ／ｍＬ）。对标准工作溶液及样液（７．２．２）等体积参插进样测定。在上述仪器条件（７．３．１）下，麻保沙星、氟罗沙星、诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、奥比沙星、沙拉沙星、二氟沙星、司帕沙星、喹酸、萘啶酸和氟甲喹保留时间约为１４．３ｍｉｎ、１７．１ｍｉｎ、１８．１ｍｉｎ、１９．６ｍｉｎ、２１．１ｍｉｎ、２３．１ｍｉｎ、２３．７ｍｉｎ、２５．０ｍｉｎ、２６．２ｍｉｎ、３０．３ｍｉｎ、３０．７ｍｉｎ、３１．６ｍｉｎ、３４．１ｍｉｎ、３８．３ｍｉｎ和３９．４ｍｉｎ。液相色谱紫外和荧光检测色谱图参见图Ａ．１和图Ａ．２。７．４ 空白试验除不加试样外，按上述测定步骤进行。８ 结果计算和表达试样中分析物的残留含量，用检测仪器的数据处理机或按式（１）计算，计算结果需将空白值扣除。犡＝犃×犮×犞犃ｓ×犿×１０００…………………………（１） 式中：犡———试样中喹诺酮药物残留含量，单位为毫克每千克（ｍｇ／ｋｇ）；犃———样液中的峰面积；犮———标准工作溶液中浓度，单位为纳克每毫升（ｎｇ／ｍＬ）；犞———样液最终定容体积，单位为毫升（ｍＬ）；犃ｓ———标准工作溶液中的峰面积；犿———试料的质量，单位为克（ｇ）。９ 测定低限和回收率测定低限和回收率见表Ｂ．１。４犛犖／犜１７５１．３—２０１１附 录 犃（资料性附录）标准物质色谱图１———麻保沙星；２———氟罗沙星；３———诺氟沙星；４———培氟沙星；５———环丙沙星；６———洛美沙星；７———丹诺沙星；８———恩诺沙星；９———奥比沙星；１０———沙拉沙星；１１———二氟沙星；１２———喹酸；１３———萘啶酸；１４———氟甲喹。图犃．１ １４种喹诺酮药物的液相色谱荧光检测色谱图图犃．２ 司帕沙星的液相色谱紫外检测色谱图５犛犖／犜１７５１．３—２０１１附 录 犅（资料性附录）测定低限和回收率表犅．１ １５种喹诺酮药物的测定低限和添加回收率（狀＝１０）化合物测定低限μｇ／ｋｇ添加浓度μｇ／ｋｇ回收率范围％鱼肉虾肉鸡肉奶粉麻保沙星１５１５８１．７～９６．８８２．０～９４．８８０．４～９６．１７９．４～９４．５５０８０．５～９３．６８０．９～９０．５８４．４～９６．７７７．１～８８．７８０８１．１～９５．３８３．０～９４．０８３．０～９６．４８０．２～９５．６氟罗沙星５．０５８２．７～９６．８８１．０～９６．６８１．０～９３．５８１．６～９６．１１０８２．６～１０２．８８１．０～９６．５８１．０～９３．８８０．９～９４．９５０８１．４～９８．７８２．３～９０．９８２．３～９１．４８１．４～９６．２诺氟沙星３．０３７７．７～８８．５７７．８～９６．２７７．８～８９．３７９．３～９４．３６８４．３～９６．３８０．４～９３．７８０．４～９５．５８６．２～９２．８２０８０．２～９４．０８３．５～８８．９８３．５～９１．３８１．４～９６．０培氟沙星３．０３７２．５～８４．８７２．５～８２．８７２．５～８８．８７８．５～９６．４６７８．４～８８．７８０．８～９６．７８０．８～９４．０７８．５～９５．８３０８２．８～９３．８７４．６～９５．９７４．６～８７．９７８．８～９６．２环丙沙星４．０４８２．３～９５．８８０．５～９８．８８０．５～９６．６８０．０～９６．０２０８４．１～１０２．４８１．０～９６．９８１．０～９５．３７９．３～９４．５１００８３．６～１０１．０８０．２～１０３．９８０．２～９６．５８３．９～９８．４洛美沙星１．０１８２．１～９６．６８２．３～９９．３８２．３～９３．３７９．３～９６．８２８６．３～９９．９８０．３～１０１．４８０．３～９３．６７８．６～９４．３１０８６．８～１０２．８８１．９～１０１．５８１．９～