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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１６８１—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１６８１—２００５蜜蜂美洲幼虫腐臭病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犃犿犲狉犻犮犪狀犳狅狌犾犫狉狅狅犱狅犳犺狅狀犲狔犫犲犲狊２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替了ＳＮ／Ｔ１６８１—２００５《蜜蜂美洲幼虫腐臭病诊断方法》。本标准与ＳＮ／Ｔ１６８１—２００５相比，主要技术变化如下：———修改了标准的名称；———增加了“现场检验检疫”、“生理特征鉴定”及“ＰＣＲ检测”内容；———修改了原标准的“采样方法”、“直接检查法”及“分离培养与鉴定”。本标准修改采用国际兽疫局（ＯＩＥ）《陆生动物疾病诊断试验和疫苗标准手册》（２００８版）中２．２．２章，主要修改如下：———原文中“ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”等内容经修改简缩后作为本标准附录Ａ；———原文格式及内容顺序排版上做了调整。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖北出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郭明星、曾宪东、冯汉利、陈建军、赵晖、颜志立、朱堂明、王振华。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１６８１—２００５。Ⅰ犛犖／犜１６８１—２０１１蜜蜂美洲幼虫腐臭病检疫技术规范１ 范围本标准规定了蜜蜂美洲幼虫腐臭病的现场检验检疫、采样、实验室诊断等检疫技术规范。本标准适用于进出境蜜蜂美洲幼虫腐臭病的检疫及本病的流行病学调查、诊断和监测。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８８ 出入境动物检疫采样３ 试剂和材料３．１ 幼虫芽孢杆菌（犘犪犲狀犻犫犪犮犻犾犾狌狊犾犪狉狏犪犲ｓｕｂｓｐ．犾犪狉狏犪犲）标准菌株由ＯＩＥ参考实验室或国家质量监督检验检疫总局指定的实验室提供。３．２ 引物３．２．１ ＰＣＲ引物上游引物：５’ＣＴＴＧＴＧＴＴＴＣＴＴＴＣＧＧＧＡＧＡＣＧＣＣ３’下游引物：５’ＴＣＴＴＡＧＡＧＴＧＣＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＧ３’扩增片段大小：１１０６ｂｐ。３．２．２ 巢式ＰＣＲ引物３．２．２．１ 巢式ＰＣＲ外侧引物上游引物：５’ＴＣＧＡＧＣＧＧＡＣＣＴＴＧＴＧＴＴ３’下游引物：５’ＣＴＡＴＣＴＣＡＡＡＡＣＣＧＧＴＣＡＧＡＧ３’扩增片段大小：９６９ｂｐ。３．２．２．２ 巢式ＰＣＲ内侧引物上游引物：５’ＣＴＴＣＧＣＡＴＧＡＡＧＴＣＡＴＧ３’下游引物：５’ＴＣＡＧＴＴＡＴＡＧＧＣＣＡＧＡＡＡＧＣ３’扩增片段大小：５７２ｂｐ。３．３ 犜犪狇酶。３．４ ｄＮＴＰｓ：含ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ各１０ｍｍｏｌ／Ｌ。３．５ ＤＮＡＭａｒｋｅｒ。３．６ 溴化乙锭。３．７ 异丙醇。３．８ １０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ·ＨＣｌ１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）。３．９ 胡萝卜酵母琼脂培养基。３．１０ 马铃薯培养基。３．１１ 酵母浸膏培养基。１犛犖／犜１６８１—２０１１４ 器材和设备４．１ ＰＣＲ扩增仪。４．２ 电泳仪及电泳槽。４．３ 凝胶成像分析仪。４．４ 恒温培养箱。４．５ 高速冷冻离心机。４．６ 普通光学显微镜。５ 现场检验检疫临床变化特征结合病原鉴定是诊断蜜蜂美洲幼虫腐臭病的依据（参见附录Ａ）。开箱，提蜂脾查看，出现下列病理变化特征之一者，可做出初步诊断。颜色变化：房盖潮湿、下陷、颜色发暗显油光。通常，患病幼虫身体变软，虫体在患病１周内体色为白色至棕黄色，２周后为深棕色，３周后为棕黑色。死亡幼虫的头部朝向房盖，虫体顺着背部下塌，虫体由正常呈“Ｃ”型变为呈竖立姿势。患病幼虫残体１个月后干涸，形成硬黑色的鳞片，紧贴巢房下侧，在３１０ｎｍ～４００ｎｍ紫外光照射下可发出荧光。巢房变化：出现“插花子脾”现象，即后期房盖穿孔，巢脾上出现空巢房与卵房、幼虫房、封盖房相间排列的现象。丝状、粘性物：用一根火柴杆插入虫体可拉出长１０ｃｍ～１５ｃｍ、褐色、胶体状、有鱼腥臭味的细丝。蛹舌现象：蛹期发生死亡的蛹在蛹房顶部有蛹头突出的现象是美洲幼虫腐臭病典型的症状之一。６ 采样按ＧＢ／Ｔ１８０８８要求，采集蜂巢的病变区域或疑似受感染的蜜蜂幼虫作为首选样品，亦可用蜂房（不小于２０ｃｍ２）或取临近蜂巢的蜜蜂食物（３０ｇ～５０ｇ）作为样品。７ 实验室诊断７．１ 病原形态学鉴定取幼虫５条～１０条，置研钵中，加少量无菌水，制成悬液，取悬液涂片、风干、固定，加２滴５％孔雀绿加热至沸腾，待明水蒸于，用蒸馏水洗涤；再加０．５％番红染色３０ｓ，水洗、吸干，镜检，若发现游离状态呈绿色的芽孢即可判定。７．２ 病原分离培养待检样品用无菌生理盐水１∶５～１∶１０稀释，接种到胡萝卜酵母琼脂培养基（见Ｂ．１）或马铃薯培养基（见Ｂ．２）或酵母浸膏培养基（见Ｂ．３）上，３５℃～３７℃培养２４ｈ，幼虫芽孢杆菌能形成浅乳白色、半透明、有光泽、微隆起的菌落。７．３ 生化特征鉴定幼虫芽孢杆菌的生化特征鉴定包括过氧化氢酶反应（见Ｃ．１）、硝酸盐还原酶反应（见Ｃ．２）、酪蛋白水解反应（见Ｃ．３）、淀粉水解反应（见Ｃ．４）、柠檬酸盐反应（见Ｃ．５）、碳水化合物产酸反应（见Ｃ．６）、白２犛犖／犜１６８１—２０１１明胶液化反应（见Ｃ．７）等试验。生化特征如下：幼虫芽孢杆菌过氧化氢酶实验呈阴性反应，硝酸盐还原酶实验呈阴性反应，产吲哚和二羟基丙酮试验阳性，分解酪氨酸试验阴性，酪蛋白水解反应阳性，淀粉水解反应阴性，脲素水解反应阳性，柠檬酸盐反应阴性，发酵试验（Ｄ葡萄糖＋，Ｌ阿拉伯糖－，甘露醇－，Ｄ术糖－，甘油＋，棉籽糖－），能迟缓性液化白明胶，不产生靛基质，Ｇ＋Ｃ为４２％～４３％。７．４ 生理特征鉴定７．４．１ 改良悬滴技术取可疑幼虫残留物样品水悬浮液一滴于盖玻片上，烘干固定，用石灰酸品红染色３０ｓ，用蒸馏水滴覆盖盖玻片，再将盖玻片倒置在涂有薄层镜油的载玻片上，用吸水纸轻轻吸干载玻片溢出的水分，在高倍显微镜下观察镜油中形成袋状水滴的区域，幼虫芽孢杆菌的芽孢在显微镜视野下呈布郎运动，其他芽孢杆菌的芽孢则静止不动。改良悬滴技术可以区别幼虫芽孢杆菌的芽孢与其他芽孢杆菌的芽孢，敏感性较低，不作为确诊的依据。７．４．２ 犎狅犾狊狋牛乳试验取患病干虫尸（或可疑样品鳞片、患病幼虫涂抹物）悬浮于加有１％脱脂牛奶溶液的小试管中，３７℃孵育，若有幼虫芽孢杆菌及其芽孢存在，此时牛乳发生凝固，接着在１０ｍｉｎ～２０ｍｉｎ内变清。７．５ 犘犆犚检测７．５．１ 核酸抽提７．５．１．１ 幼虫芽孢杆菌培养物的核酸抽提取可疑菌落悬浮于５０μＬ蒸馏水中，９５℃，水浴１５ｍｉｎ，５０００犵，离心５ｍｉｎ，其上清液作为核酸模板。７．５．１．２ 可疑病理物的核酸抽提将两只可疑患病幼虫于１ｍＬ无菌蒸馏水中匀质后，取该匀质液１００μＬ加入到９００μＬ无菌蒸馏水中混匀，再取１００μＬ混悬液９５℃，水浴１５ｍｉｎ，５０００犵，离心５ｍｉｎ，取上清液作为模板。７．５．１．３ 芽孢的核酸抽提芽孢悬浮液４℃，６０００犵，离心３０ｍｉｎ，弃上清液。沉淀物最大功率超声波处理５ｍｉｎ，然后加入３０μＬ１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ·ＨＣｌ１ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）。蜂蜜中的芽孢，用无菌蒸馏水透析后进行上述处理。也可将芽孢培养后再提取ＤＮＡ，即：将可疑样品接种营养肉汤，３７℃培养２ｈ～２４ｈ，１４５００犵，离心５ｍｉｎ，沉淀用无菌蒸馏水清洗两次，再用２００μＬ的无菌蒸馏水悬浮。按照７．５．１．１煮沸法提取ＤＮＡ。７．５．２ 普通犘犆犚７．５．２．１ 反应体系反应体系成分：１０×ＰＣＲ缓冲液５μＬ、２５ｍｍｏＬ／Ｌ氯化镁５μＬ、２５ｍｍｏＬ／ＬｄＮＴＰ２μＬ、上游引物和下游引物（４０ｐｍｏｌ）各１．０μＬ、犜犪狇酶２．５Ｕ、ＤＮＡ１０μＬ，加水到５０μＬ。设立标准菌株悬液按７．５．１．１抽提的核酸为模板作为阳性对照、健康虫体按７．５．１．２抽提的核酸为模板作为阴性对照、双蒸水为模板作为空白对照。３犛犖／犜１６８１—２０１１７．５．２．２ 反应条件９５℃预变性１０ｍｉｎ，然后９３℃６０ｓ、５５℃３０ｓ、７２℃６０ｓ，３０个循环，最后７２℃延伸５ｍｉｎ，４℃保存。７．５．３ 巢式犘犆犚７．５．３．１ 外侧扩增反应体系及反应条件反应体系成分：１０×ＰＣＲ缓冲液５μＬ、２５ｍｍｏＬ／Ｌ氯化镁５μＬ、２５ｍｍｏＬ／ＬｄＮＴＰ２μＬ、外部扩增上游引物和下游引物（４０ｐｍｏｌ／Ｌ）各１．０μＬ、犜犪狇酶１．２５Ｕ、芽孢提取的ＤＮＡ模板１０μＬ，加水到５０μＬ。设立标准菌株悬液按７．５．１．１抽提的核酸为模板作为阳性对照、健康虫体按７．５．１．２抽提的核酸为模板作为阴性对照、双蒸水为模板作为空白对照。外侧扩增反应条件：９４℃３０ｓ、６９℃～５９℃（每一个循环退火温度降低０．５℃的ＴｏｕｃｈｄｏｗｎＰＣＲ）３０ｓ、７２℃４５ｓ，２０个循环，然后９４℃３０ｓ、５９℃３０ｓ、７２℃４５ｓ，２０个循环，最后７２℃延伸５ｍｉｎ，４℃保存。７．５．３．２ 内侧扩增反应体系及反应条件反应体系成分：１０×ＰＣＲ缓冲液５μＬ、２５ｍｍｏＬ／Ｌ氯化镁５μＬ、２５ｍｍｏＬ／ＬｄＮＴＰ２μＬ、内部扩增上游引物和下游引物（４０ｐｍｏｌ／Ｌ）各１．０μＬ、犜犪狇酶１．２５Ｕ、外部扩增反应产物（作为模板）１μＬ，加水到５０μＬ。设立外侧扩增反应中阳性对照、阴性对照的扩增产物为相应的阳性对照、阴性对照，双蒸水为模板作为空白对照。内侧扩增反应条件：９４℃３０ｓ、５９℃３０ｓ、７２℃４５ｓ，３０个循环，最后７２℃延伸５ｍｉｎ，４℃保存。７．５．４ 电泳使用１％琼脂糖凝胶进行电泳，溴化乙锭终浓度为０．５μｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ，１００Ｖ电泳约３０ｍｉｎ。采用凝胶成像分析仪进行扩增产物的分析。７．５．５ 结果７．５．５．１ 普通犘犆犚阳性对照扩增片段大小１１０６ｂｐ，阴性对照、空白对照无扩增产物。样品扩增片段大小与阳性对照一致即为阳性，若无扩增片段或扩增片段大小与阳性对照不符即为阴性。阳性片断应测序并与参考序列（参见附录Ｄ）进行比对。７．５．５．２ 巢式犘犆犚阳性对照外部扩增片段大小为９６９ｂｐ、内部扩增片段大小为５７２ｂｐ，阴性对照、空白对照无扩增产物。样品两次扩增片段大小均与阳性对照一致即为阳性，若两次扩增片段大小均无扩增产物或与阳性对照不一致，即为阴性。阳性片断应测序并与参考序列（参见附录Ｄ）进行比对。４犛犖／犜１６８１—２０１１附 录 犃（资料性附录）蜜蜂美洲幼虫腐臭病 蜜蜂美洲幼虫腐臭病（Ａｍｅｒｉｃａｎｆｏｕｌｂｒｏｏｄｏｆｈｏｎｅｙｂｅｅｓ）是由幼虫芽孢杆菌（幼虫类芽孢杆菌幼虫亚种，犘犪犲狀犻犫犪犮犻犾犾狌狊犾犪狉狏犪犲ｓｕｂｓｐ．犾犪狉狏犪犲）引起的蜜蜂幼虫和蛹的一种细菌性、急性、毁灭性传染病。特征为病蜂的蜂盖子脾下陷、穿孔、封盖幼虫和大幼虫死亡等。本病最初发生于英国，后传到欧美各国，现全世界均有发生。世界动物卫生组织（ＯＩＥ）把此病列为检疫对象。蜜蜂美洲幼虫腐臭病的病原为幼虫芽孢杆菌，其营养细胞没有感染力，只有芽孢才能诱发疾病。一个感染的幼虫体内可产生１０亿多个芽孢。其芽孢能抵抗热、消毒剂和干燥，９０℃、１００℃水中分别能活３ｈ和１３ｈ，０．１％升汞、福尔马林溶液中分别能活５ｄ和６ｈ，在自然界中可生存３５年以上。悬浮在蜂蜜中的芽孢阳光照射下能存活４周～６周。受幼虫芽孢杆菌污染的饲料、巢脾和花粉均可传播此病，内勤蜂在清理巢房和清除患病幼虫尸体时，把病菌带进蜜、粉房，通过饲喂将幼虫芽孢杆菌传给健康幼虫。用带菌的蜂蜜喂蜂或随意调换巢脾可促使此病在蜂群间传播。蜂场上的盗蜂及迷巢蜂也可传播本病。蜡螟、人和小蜂螨等传播美洲幼虫腐烂病方面起着很大的作用。本病多在夏秋季发生流行，潜伏期为７ｄ左右，通常感染孵化２４ｈ左右的幼虫，其易感性随虫龄增长而下降，孵化５３ｈ后的幼虫就不再感染此病了。该病的发生与蜜蜂的品种