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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１６７５—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１６７５—２００５真鲷虹彩病毒病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉狉犲犱狊犲犪犫狉犲犪犿犻狉犻犱狅狏犻狉狌狊犱犻狊犲犪狊犲（犚犛犐犞犇）２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准真鲷虹彩病毒病检疫技术规范ＳＮ／Ｔ１６７５—２０１１中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街１６号邮政编码：１０００４５网址ｗｗｗ．ｓｐｃ．ｎｅｔ．ｃｎ电话：６８５２３９４６ ６８５１７５４８中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本８８０×１２３０１／１６ 印张１ 字数２５千字２０１１年１１月第一版 ２０１１年１１月第一次印刷印数１—１６００书号：１５５０６６·２２２６３９ 定价１８．００元书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１６７５—２００５《鱼真鲷虹彩病毒聚合酶链反应操作规程》。本标准与ＳＮ／Ｔ１６７５—２００５相比，主要技术差异如下：———增加现场诊断；———增加间接荧光抗体试验；———增加病毒的细胞分离；———对原标准中聚合酶链式反应（ＰＣＲ）进行修改。本标准修改采用了ＯＩＥ《水生动物疾病诊断手册》（２００９版）第２．３．７章。本标准与ＯＩＥ《水生动物疾病诊断手册》（２００９版，第２．３．７章）相比，主要差别如下：———删除了ＯＩＥ手册中真鲷虹彩病毒病防控和流行病学内容；———重新编排了格式。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：吴文忠、兰文升、刘荭、吴海峰、方成俊、张伯强、郑腾。Ⅰ犛犖／犜１６７５—２０１１真鲷虹彩病毒病检疫技术规范１ 范围本标准规定了真鲷虹彩病毒病（ｒｅｄｓｅａｂｒｅａｍｉｒｉｄｏｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅ，ＲＳＩＶＤ）的临床和实验室检测标准方法。本标准适用于水生动物真鲷虹彩病毒病的检测和诊断。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８８ 出入境动物检疫采样。３ 概述真鲷虹彩病毒病（ＲＳＩＶＤ）是养殖海水鱼类的一种重要疾病，被列入世界动物卫生组织（ＯＩＥ）水生动物疫病名录，是水生动物及其产品的国际贸易中，所监测的鱼类重要疾病之一（参见附录Ａ）。对ＲＳＩＶ的监测、检测和诊断方法见附录Ｂ。４ 缩略语下列缩略语适用于本文件。ＣＰＥ（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔ）：细胞病变ＩＦＡＴ（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｎｔｉｂｏｄｙｔｅｓｔｓ）：免疫荧光抗体试验ＩＳＫＮＶ（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｓｐｌｅｅｎａｎｄｋｉｄｎｅｙｎｅｃｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ）：传染性脾肾坏死病毒ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）：聚合酶链式反应ＲＳＩＶＤ（ｒｅｄｓｅａｂｒｅａｍｉｒｉｄｏｖｉｒａｌｄｉｓｅａｓｅ）：真鲷虹彩病毒病ＲＳＩＶ（ｒｅｄｓｅａｂｒｅａｍｉｒｉｄｏｖｉｒａｌｖｉｒｕｓ）：真鲷虹彩病毒５ 主要仪器和设备５．１ 普通倒置显微镜。５．２ 荧光显微镜。５．３ 电子显微镜。５．４ 热循环扩增仪（ＰＣＲ仪）。５．５ 恒温培养箱。５．６ 离心机。５．７ 凝胶成像仪。５．８ ＤＮＡ电泳系统。１犛犖／犜１６７５—２０１１６ 主要试剂和材料６．１ ＧＦ（Ｇｒｕｎｔｆｉｎ）细胞系：由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供。６．２ Ｌ１５培养基（含Ｅａｇｌｅ’ｓ平衡盐溶液）。６．３ 小牛血清（ＦＢＳ）。６．４ 标记了异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）的抗小鼠的抗抗体。６．５ 抗ＲＳＩＶ的单克隆抗体：由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供。６．６ ＰＣＲ有关试剂。６．７ ＲＳＩＶ：由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供。６．８ 引物：引物１：１Ｆ：５’ＣＴＣＡＡＡＣＡＣＴＣＴＧＧＣＴＣＡＴＣ３’引物２：１Ｒ：５’ＧＣＡＣＣＡＡＣＡＣＡＴＣＴＣＣＴＡＴＣ３’引物１和引物２可扩增ＲＳＩＶ和ＩＳＫＮＶ中５７０ｂｐ的基因片段。引物３：４Ｆ：５’ＣＧＧＧＧＧＣＡＡＴＧＡＣＧＡＣＴＡＣＡ３’引物４：４Ｒ：５’ＣＣＧＣＣＴＧＴＧＣＣＴＴＴＴＣＴＧＧＡ３’引物３和引物４只扩增ＲＳＩＶ５６８ｂｐ的基因片段。７ 抽样出境检疫抽样应在原产养殖场进行，进境检疫抽样应在进出境临时检疫隔离场（池）进行，抽样要求根据ＧＢ／Ｔ１８０８８的要求执行，抽样数按照附录Ｃ确定。８ 现场诊断８．１ 临床症状感染鱼活力差、严重贫血、鳃丝有出血点、脾脏肿大。８．２ 显微病理８．２．１ 组织涂片脾脏组织涂片后，经Ｇｉｅｍｓａ染色，可看到异常的巨大细胞。８．２．２ 切片在脾脏、心脏或肠等组织中可见异常的巨大细胞。８．２．３ 显微病理通过电子显微镜观察，在巨大细胞中可见直径为２００ｎｍ～２４０ｎｍ的病毒粒子。９ 病毒的细胞分离９．１ 病原接种细胞９．１．１ 使用ＧＦ（Ｇｒｕｎｔｆｉｎ）细胞系分离病毒。２犛犖／犜１６７５—２０１１９．１．２ 从病鱼的脾和（或）肾组织采集样品，研磨成为组织匀浆，含１０％小牛血清（ＦＢＳ）的Ｌ１５培养基（含有１０００ＩＵ／ｍＬ青霉素和５０μｇ／ｍＬ链霉素）稀释组织细胞并且置于２５℃培养箱中孵育２４ｈ，以保证随后ＲＳＩＶ的成功分离。９．１．３ 以ＲＳＩＶ病毒作为阳性对照，未感染的细胞作为阴性对照。随后出现病毒性细胞病变（ＣＰＥ），可以使用间接免疫荧光抗体试验（ＩＦＡＴ）和（或）聚合酶链反应（ＰＣＲ）鉴定病毒。９．１．４ 把１０倍稀释的组织匀浆上清液再做１０倍稀释，在无菌条件下，分别以适当的体积接种生长了２４ｈ的单层细胞，每１００μＬ稀释液接种到单层细胞的面积应不小于２ｃｍ２。９．１．５ 在２５℃±１℃恒温环境吸附０．５ｈ～１ｈ，加入含有２％胎牛血清的细胞培养液（ｐＨ７．６），保证２４孔板每孔接种１ｍＬ，然后置于２５℃±１℃恒温培养箱继续培养。９．２ 细胞培养的观察９．２．１ 每天观察接种的样品及阳性对照，持续观察１０ｄ。如果稀释的匀浆上清液接种后，在细胞培养中出现ＣＰＥ，立即进行鉴定。９．２．２ 如果接种１０ｄ后没有ＣＰＥ出现（阳性对照已出现ＣＰＥ），７ｄ后要再传代培养一次。９．２．３ 如果阳性对照一直没有ＣＰＥ，则要用新的敏感细胞及新批次样品重新进行接种试验。９．３ 传代培养和结果判定９．３．１ 从所有接种了组织匀浆上清液的细胞培养板的孔中收集细胞培养液。９．３．２ 按９．１．４描述的方法接种到单层细胞。９．３．３ 按９．２．１描述进行培养和观察。９．３．４ 如果ＣＰＥ仍未出现，则试验结果判为阴性。１０ 间接荧光抗体试验１０．１ 鉴定犚犛犐犞感染单层细胞的间接荧光抗体试验１０．１．１ 总则检测的样品为丙酮固定的感染并出现了ＣＰＥ的单层细胞，用无感染的单层细胞作为阴性对照，用ＲＳＩＶ感染的单层细胞作为阳性对照，从细胞培养中分离到病毒后，直接利用间接荧光抗体试验进行鉴定。１０．１．２ 试验步骤１０．１．２．１ 在载玻片上制备单层细胞１０．１．２．１．１ 将细胞液加至具有旋涡的载玻片上，细胞培养液中的小牛血清（ＦＣＳ）可减少到２％～４％，通常在２５℃±１℃孵育２４ｈ，单层细胞即可覆盖８０％的盖玻片。１０．１．２．１．２ 准备好用作感染的单层细胞后，在当天或传入细胞的第２天，直接将１０倍稀释的待鉴定的病毒悬液无菌接种到细胞培养孔，在２５℃培养２４ｈ～７２ｈ。１０．１．２．１．３ 当ＣＰＥ出现时，吸出细胞培养液，用ＰＢＳ漂洗３次，然后用预冷固定液漂洗３次，空气中干燥，用冷丙酮（－２０℃）固定１０ｍｉｎ。１０．１．２．１．４ 单层细胞在空气中干燥至少３０ｍｉｎ，然后立刻做下一步处理或置于－２０℃保存。１０．１．２．２ 单层细胞的处理１０．１．２．２．１ 制备抗ＲＳＩＶ的单克隆抗体溶液，将单层细胞在３７℃的湿盒子里用抗ＲＳＩＶ的单克隆抗３犛犖／犜１６７５—２０１１体作用３０ｍｉｎ，用ＰＢＳ把单层细胞洗３次，约５ｍｉｎ。１０．１．２．２．２ 加入适当浓度标记了异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）的抗小鼠的抗抗体在暗的湿盒中３７℃培育３０ｍｉｎ。用ＰＢＳ将单层细胞洗３次，约５ｍｉｎ。用ｐＨ８．５的甘油盐水封片，立即用显微镜观察处理过的单层细胞。１０．１．３ 结果判定用荧光显微镜检查处理的玻片，阳性和阴性对照应完全成立，这样才能进行其他样品的观察。如细胞质中充满弥散性的荧光，则检测结果为阳性。１０．２ 病料组织的间接荧光抗体试验（犐犉犃犜）１０．２．１ 实验步骤１０．２．１．１ 取样部位取脾脏。１０．２．１．２ 阳性和阴性对照的选用用已经确诊感染鱼的脾脏组织制备的涂片作为阳性对照，作为阳性对照所用的鱼脾脏组织风干和固定的涂片可以从ＯＩＥ参考试验室获得。用健康鱼的脾脏组织制备的涂片作为阴性对照。１０．２．１．３ 样品处理放尽鱼血，取脾脏置于干净的载玻片上涂片。将涂片在空气中干燥２０ｍｉｎ，冷丙酮固定，用抗ＲＳＩＶ的单克隆抗体在３７℃对涂片作用３０ｍｉｎ，ＰＢＳ洗３次，约５ｍｉｎ。１０．２．１．４ 样品显色加入适当浓度标记了异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）的抗小鼠的抗抗体在暗的湿盒中３７℃培育３０ｍｉｎ，标记ＦＩＴＣ的抗体通常是兔源或羊源抗体。用ＰＢＳＴ把单层细胞洗３次，约５ｍｉｎ。用ｐＨ８．５的甘油盐水封片，立即用显微镜观察处理过的单层细胞。１０．２．１．５ 结果观察用荧光显微镜检查。阳性和阴性对照应完全成立，这样才能进行其他样品的观察。异常肿大的细胞带有荧光即可以证实可能感染ＲＳＩＶ。１０．２．２ 结果判定如果实验结果为阳性，可以初步判断抽样的鱼感染了ＲＳＩＶ并患有ＲＳＩＶＤ。如果实验结果为阴性，则将组织器官样品按前面所描述的进行细胞培养分离病毒，进一步确诊。１１ 聚合酶链式反应（犘犆犚）１１．１ 实验步骤１１．１．１ 样品为病鱼的脾组织或细胞培养中出现ＣＰＥ的上清液。４犛犖／犜１６７５—２０１１１１．１．２ 阳性和阴性对照从非感染鱼脾或非感染的细胞培养上清液提取的ＤＮＡ作为阴性对照。用被证实感染ＲＳＩＶ的鱼脾组织或被感染细胞培养物的上清液提取的ＤＮＡ作为阳性对照。对照的选择取决于被检测样品的种类。１１．１．３ 抽提犇犖犃从器官样品或分离病毒的细胞培养上清液中提取ＤＮＡ。核酸提取可使用市售商品化的ＤＮＡ抽提试剂盒。用已证实感染ＲＳＩＶ或ＩＳＫＮＶ的器官或细胞培养上清液作为阳性对照，用健康鱼组织或无病毒感染细胞培养物的上清液作为阴性对照。１１．１．４ 犘犆犚扩增１１．１．４．１ 引物的选用在ＰＣＲ扩增中，上游引物１Ｆ和下游引物１Ｒ可以共扩增ＲＳＩＶ和ＩＳＫＮＶ的基因片段，引物４Ｆ和４Ｒ只能扩增ＲＳＩＶ的基因片段。因此，引物４Ｆ和４Ｒ具有特异性鉴别ＲＳＩＶ和ＩＳＫＮＶ的作用。１１．１．４．２ 犇犖犃的扩增将提取的ＤＮＡ（１μＬ）加入到含有各引物（０．４μｍｏｌ／Ｌ）、ｄＮＴＰ（０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｅｘ犜犪狇（１．２５Ｕ）和Ｍｇ２＋（２ｍｍｏｌ／Ｌ）的ＰＣＲ反应体系中，反应液在自动的热循环仪（ＰＣＲ仪）按设计的程序运行：９４℃３０ｓ，５８℃６０ｓ，７２℃６０ｓ，扩增３０个循环，最后于７２℃延伸５ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增反应产物用琼脂糖凝胶电泳分析。１１．２ 结果判定１１．２．１ 结果判定阴性对照和空白对照没有该扩增带。待测样品电泳后，电泳后观察到预期长度的核酸片段，则判定为阳性，无扩增带或扩增带的大小不是预期长度的条带判为阴性。１１．２．２ 检测结果的释疑用引物组１Ｆ和１Ｒ的ＰＣＲ阳性结果且经测序证实其特异性后（参见附录Ｄ），表明存在ＲＳＩＶ或ＩＳＫＮＶ，该病是ＲＳＩＶＤ。如果用引物组１Ｆ和１Ｒ的ＰＣＲ扩增反应出现阳性结果，继续使用引物组４Ｆ和４Ｒ做选择性ＰＣＲ，阳性结果表明该病毒是ＲＳＩＶ，并引起ＲＳＩＶＤ。选择性ＰＣＲ的阴性结果表明该病毒是Ｉ