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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１６７４—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１６７４—２００５锦鲤疱疹病毒病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犓狅犻犺犲狉狆犲狉狊狏犻狉狌狊犱犻狊犲犪狊犲２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替了ＳＮ／Ｔ１６７４—２００５《锦鲤疱疹病毒分离和聚合酶链反应操作规程》。本标准与ＳＮ／Ｔ１６７４—２００５相比，主要技术变化如下：———修改了标准的名称；———增加了“病理变化观察”、“电镜观察”及“间接免疫荧光（ＩＦＡＴ）”方法；———修改了原标准的ＰＣＲ方法。本标准修改采用国际兽疫局（ＯＩＥ）《水生动物疾病诊断手册》（２００９版）中第２．３．６章，主要修改如下：———原文中“Ｄｉｓｅａｓｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ”内容经修改简缩后作为本标准附录Ａ；———原文第５节内容删去；———原文格式及内容顺序排版上作了调整。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖北出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郭明星、江育林、刘荭、陈建军、黄晟、罗志萍、朱堂明、赵晖。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１６７４—２００５。Ⅰ犛犖／犜１６７４—２０１１锦鲤疱疹病毒病检疫技术规范１ 范围本标准规定了锦鲤疱疹病毒病诊断的临床症状、采样、间接免疫荧光、组织病理学观察、病毒分离、电镜观察、ＰＣＲ检测等检疫技术规范。本标准适用于进出境锦鲤疱疹病毒病的检疫。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ１８０８８ 出入境动物检疫采样３ 试剂和材料３．１ 锦鲤疱疹病毒（犓狅犻犺犲狉狆犲狊狏犻狉狌狊，ＫＨＶ）：标准毒株由ＯＩＥ参考实验室或国家质量监督检验检疫总局指定的实验室提供。３．２ 细胞系：锦鲤鳍细胞（ＫＦ１）、脑组织（ＣＣＢ）细胞系由国家质量监督检验检疫总局指定实验室提供。３．３ 引物３．３．１ ＫＨＶ胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（ＴＫ）基因ＰＣＲ扩增引物序列：上游引物：５’ＧＧＧＴＴＡＣＣＴＧＴＡＣＧＡＧ３’下游引物：５’ＣＡＣＣＣＡＧＴＡＧＡＴＴＡＴＧＣ３’扩增产物大小为４１０ｂｐ。３．３．２ 基于检测ＫＨＶＧｒａｙ犛狆犺基因建立ＰＣＲ方法的引物序列为：ＫＨＶＳｐｈＩ５Ｆ：５’ＧＡＣＡＣＣＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＧＧＡＧ３’ＫＨＶＳｐｈＩ５Ｒ：５’ＧＡＣＡＣＡＴＧＴＴＡＣＡＡＴＧＧＴＣＧＣ３’扩增产物大小为２９２ｂｐ。３．４ 犜犪狇酶。３．５ ｄＮＴＰｓ：含ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ各１０ｍｍｏｌ／Ｌ。３．６ 无水乙醇：使用前预冷到－２０℃。３．７ 蛋白酶Ｋ。３．８ ＤＮＡＭａｒｋｅｒ。３．９ 溴化乙锭。４ 器材和设备４．１ ＰＣＲ扩增仪。４．２ 电泳仪及电泳槽。１犛犖／犜１６７４—２０１１４．３ 凝胶成像分析仪。４．４ 恒温培养箱。４．５ 高速冷冻离心机。４．６ 细胞培养瓶或培养板。４．７ 普通光学显微镜、倒置显微镜及电子显微镜。４．８ 切片机。５ 临床症状锦鲤疱疹病毒病（犓狅犻犺犲狉狆犲狊狏犻狉狌狊ｄｉｓｅａｓｅ，ＫＨＶＤ）是一种由锦鲤疱疹病毒引起的鲤鱼和锦鲤的高度传染性败血症疾病，主要临床表现为行动迟缓，鱼眼凹陷，平衡失调，皮肤和鳃苍白、颜色不规则伴有中度至严重的鳃坏死，体表多黏液。该病的传染源为临床上被感染的鱼及隐性带毒鱼，临床症状同许多普通细菌与寄生虫感染的症状相似。患病鱼往往在１ｄ～２ｄ内即出现死亡（参见附录Ａ）。６ 采样６．１ 直接采样按照ＧＢ／Ｔ１８０８８采样，取鳃、肾、脾脏、脑等组织作为样品。６．２ 共同培养后取样通常用于检疫比较贵重的鱼，如比较名贵的锦鲤进出境展览检疫等。处理方法：将待检鱼与经检查没有感染ＫＨＶ的鲤鱼放在检疫隔离场于２３℃～２８℃下共同饲养２周～４周，按６．１的要求取鲤鱼样作为检疫样品。７ 检验方法７．１ 病理变化观察取鳃、肾、脾、肝组织制成病理切片，在普通显微镜下观察组织细胞病理变化。典型ＫＨＶ感染可观察到鳃组织增生、次级鳃丝肥大融合、鳃上皮细胞的细胞核肿大并出现弥散性嗜酸性核内包涵体，肾、脾、肝实质细胞坏死。７．２ 电镜观察电子显微镜下进一步观察组织切片，ＫＨＶ感染的病鱼细胞中能看到弥散性嗜酸性核内包涵体，并可见到有疱疹病毒样粒子。７．３ 间接免疫荧光（犐犉犃犜）将待检鱼放血后，取其肾组织印迹于干净载玻片或者细胞培养皿，空气中风干２０ｍｉｎ，０．０１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，ｐＨ值７．２）冲洗一次，然后－２０℃预冷的丙酮或３０％＋丙酮７０％乙醇混合溶液轻轻冲洗３次。按０．５ｍＬ／２ｃｍ２加入固定液，固定１５ｍｉｎ，风干至少３０ｍｉｎ后立刻进行下一步处理或－２０℃保存。用０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ值７．２的ＰＢＳ）冲洗润湿四次，然后彻底风干。用０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳＴ以合适的比例稀释ＫＨＶ的血清或纯化抗体，以０．２５ｍＬ／２ｃｍ２的抗体稀释２犛犖／犜１６７４—２０１１液在恒湿箱中３７℃处理１ｈ，再ＰＢＳＴ冲洗四次。然后用５％的脱脂牛奶或１％的牛血清白蛋白ＢＳＡ的ＰＢＳＴ在３７℃封闭３０ｍｉｎ，再ＰＢＳＴ冲洗四次，接着用ＦＩＴＣ标记的二抗处理在３７℃处理１ｈ，再ＰＢＳＴ冲洗四次，然后用０．５ｍＬ／２ｃｍ２ＰＢＳ冲洗，立刻用１０×目镜和２０×～４０×物镜在紫外光下进行观察。同时设立阳性对照、阴性对照。７．４ 病毒分离７．４．１ 样品处理取待检样品用组织研磨器匀浆成糊状，按１∶１０加入含双抗（１０００ＩＵ／ｍＬ青霉素和１０００μｇ／ｍＬ链霉素）的细胞培养液（见Ｂ．２）悬浮，收于灭菌离心管中，１５℃静置２ｈ～４ｈ或４℃过夜。７０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，收集上清液。７．４．２ 病毒分离细胞接种前用胰酶ＥＤＴＡ混合消化液（见Ｂ．１）处理，并将１∶１０的组织匀浆上清液再依次１０倍稀释，然后将１∶１０、１∶１００和１∶１０００三个稀释度的上清液以适当体积分别接种到生长２４ｈ～４８ｈ单层细胞中，每孔（５ｃｍ２）的细胞单层最多接种１００μＬ稀释液。１８℃～２２℃吸附０．５ｈ～１ｈ后，加入细胞培养液（１ｍＬ／ｃｍ２～１．５ｍＬ／５ｃｍ２），置于２０℃～２５℃培养。试验应有２孔阳性对照（接种ＫＨＶ标准株）和空白对照（未接种病毒的细胞）。阳性对照和待测样品都接种细胞后，７ｄ内每天用４０×～１００×倒置显微镜检查。空白对照细胞应当正常。如果接种了被检匀浆上清液稀释液的细胞培养中出现细胞病变（ＣＰＥ），应立即进行鉴定。如果除阳性对照细胞外，没有ＣＰＥ出现，则在培养７ｄ后再用敏感细胞进行传代培养。传代时，将接种了组织匀浆上清液稀释液的细胞单层培养物冻融一次，以７０００ｒ／ｍｉｎ，４℃离心１５ｍｉｎ，收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，培养７ｄ。每天用４０×～ｒ／ｍｉｎ，４℃离心１５ｍｉｎ，收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，培养７ｄ。每天用４０×～１００×倒置显微镜检查。若阳性对照未出现ＣＰＥ，则应换用敏感细胞和一批新的组织样品重新进行另一系列的病毒学检查。７．５ 犘犆犚检测７．５．１ 核酸抽提按１／１０（质量／体积）将待检样品（鱼鳃去掉表面黏液）与灭菌生理盐水混合匀浆。取１００μＬ组织匀浆加到有５００μＬ组织裂解液（见Ｂ．３）的１．５ｍＬ离心管中，６５℃处理１ｈ。加入２０μＬ蛋白酶Ｋ（２０ｍｇ／ｍＬ），５５℃孵育３０ｍｉｎ。加入等体积酚三氯甲烷异戊醇（２５∶２４∶１）振荡混匀，静置２０ｓ，１３５００ｒ／ｍｉｎ，４℃，离心３ｍｉｎ。取水相移入新管中，加入等体积三氯甲烷异戊醇（２４∶１）混匀，静置２０ｓ，１００００ｒ／ｍｉｎ，４℃，离心１５ｍｉｎ。取上层水相溶液（约６００μＬ）到新的离心管中。加入１．５倍体积（约９００μＬ），－２０℃预冷无水乙醇混匀，静置２０℃过夜，１５０００ｒ／ｍｉｎ，４℃，离心５ｍｉｎ，弃上清液。加入５００μＬ的７０％乙醇，轻轻漂洗ＤＮＡ沉淀两遍，弃上清液，吸水纸去除残余的乙醇，自然干燥１０ｍｉｎ～１５ｍｉｎ。加５０μＬ双蒸水溶解沉淀，置－２０℃保存。也可用其他商业化试剂盒或其他方法抽提病毒ＤＮＡ。７．５．２ 反应体系反应体系构成：１０倍ＰＣＲ缓冲液１０μＬ、２５ｍｍｏｌ／Ｌ氯化镁１０μＬ、ｄＮＴＰ２μＬ、引物（４０ｐｍｏｌ）各２．５μＬ、犜犪狇酶５Ｕ、模板１０μＬ，加水到１００μＬ。设立标准毒株感染的鱼组织按７．５．１抽提的ＤＮＡ为３犛犖／犜１６７４—２０１１模版作为阳性对照、健康鱼组织按７．５．１为模板作为阴性对照、双蒸水为模板作为空白对照。７．５．３ 反应条件ＫＨＶ胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（ＴＫ）基因的ＰＣＲ扩增：９４℃预变性５ｍｉｎ，然后９５℃６０ｓ、５５℃６０ｓ、７２℃６０ｓ，４０个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃保存。ＫＨＶＧｒａｙ犛狆犺基因的ＰＣＲ扩增：９４℃预变性５ｍｉｎ，然后９５℃６０ｓ、６３℃６０ｓ、７２℃６０ｓ，３０个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃保存。７．５．４ 电泳使用１％琼脂糖凝胶进行电泳，溴化乙锭终浓度为０．５μｇ／ｍＬ～１μｇ／ｍＬ，１００Ｖ电泳约２０ｍｉｎ。采用凝胶成像分析仪进行扩增产物的分析。阳性对照的ＫＨＶ胸腺嘧啶脱氧核苷激酶ＴＫ基因的ＰＣＲ扩增产物为４１０ｂｐ，Ｇｒａｙ犛狆犺基因的ＰＣＲ扩增产物为２９２ｂｐ；阴性对照扩增无产物。样品扩增片段大小与阳性对照一致即为阳性，若样品扩增无产物或者产物片段大小不一致即为阴性。阳性扩增片段需进行测序并与参考序列（参见Ｃ．１、Ｃ．２）进行比对。８ 综合判断标准８．１ 可疑病例的确定出现下列的一种或多种情形，即为可疑：ａ） 鱼群出现锦鲤疱疹病毒病的典型临床症状；ｂ） 组织切片呈现锦鲤疱疹病毒病的典型组织病理变化；ｃ） 样品接种敏感细胞，培养后观察到典型的ＣＰＥ，但未鉴定病原；ｄ） 在电镜下能观察到核内包涵体中有疱疹病毒样粒子；ｅ） ＩＦＡＴ结果为阳性；ｆ） ＰＣＲ检测结果阳性；ｇ） 从锦鲤疱疹病毒病确诊或可疑区域转移至非锦鲤疱疹病毒病区域的带病的活鱼；ｈ） 与锦鲤疱疹病毒病确诊区域有相关的其他确定的流行病学联系。８．２ 确诊病例的判定若出现与锦鲤疱疹病毒病一致的典型临床症状、组织病理变化和死亡，且下列至少一种检测结果为阳性，即可确诊：ａ） ＰＣＲ检测结果呈阳性；ｂ） ＩＦＡＴ结果为阳性；ｃ） 病毒分离鉴定为阳性。若未出现与锦鲤疱疹病毒病一致的典型临床症状、组织病理变化和死亡，则以上两种及以上不同方法的检测结果呈阳性才能确诊为锦鲤疱疹病毒病。４犛犖／犜１６７４—２０１１附 录 犃（资料性附录）锦鲤疱疹病毒病 锦鲤疱疹病毒病（犓狅犻犎犲狉狆犲狊狏犻狉狌狊ｄｉｓｅａｓｅ，ＫＨＶＤ）是锦鲤疱疹病毒引起的一种鲤鱼和锦鲤的高度传染性败血症疾病，主要临床表现为行动迟缓，鱼眼凹陷，平衡失调，皮肤和鳃苍白、颜色不规则伴有中度至严重的鳃坏死，体表多黏液，但大多数无皮肤溃疡或出血。该病的传染源为临床上被感染的鱼及隐性带毒鱼，临床症状同许多普通细菌与寄生虫感染的症状相似。患病鱼在１ｄ～２ｄ内就会死亡。传播方式为水平传播，感染ＫＨＶ的锦鲤在低温下不发病，成为传染源。ＫＨＶ的发病温度是１６℃～２５℃，带毒鱼１３℃～２３℃条件下运输会大批死亡。患病锦鲤常发生继发或并发感染。自然条件下，鲤鱼、锦鲤及其杂交品种对ＫＨＶ易感。感染ＫＨＶ的鱼苗最快在３ｄ内发病，一般情况下，８ｄ～２１ｄ可在新鱼苗中观察到病症。锦鲤疱疹病毒（犓狅犻犎犲狉狆犲狊狏犻狉狌狊，ＫＨＶ），是球状、有囊膜的ＤＮＡ病毒，基因组为１５０ｋｂ、２７７ｋｂ和２９５ｋｂ不等。直径１７０ｎｍ～２３０ｎｍ，去掉囊膜后的衣壳直径１００ｎｍ～１１０ｎｍ。病毒在３５℃４８ｈ以及在ｐＨ值大于１１或小于３的条件下丧失感染力，６０℃３０ｍｉｎ可以灭活