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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１４４９—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１４４９—２００４马流行性淋巴管炎检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犲狆犻狕狅狅狋犻犮犾狔犿狆犺犪狀犵犻狋犻狊２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１４４９—２００４《马流行性淋巴管炎检疫方法》。本标准与ＳＮ／Ｔ１４４９—２００４相比，主要的技术性变化如下：———增加了临床诊断（见第４章）；———病理组织学鉴定（见５．４．３）；———增加了荧光抗体试验（见６．１）；———增加了间接血凝试验（见６．３）。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：朱来华、梁成珠、郑小龙、邓明俊、肖西志、岳志芹、辛学谦、孙涛、王群。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１４４９—２００４。Ⅰ犛犖／犜１４４９—２０１１马流行性淋巴管炎检疫技术规范１ 范围本标准规定了马流行性淋巴管炎的临床诊断、病原分离鉴定、荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验、间接血凝试验、皮肤过敏反应试验等检疫技术。本标准适用于进出口马、骡、驴等马属动物的马流行性淋巴管炎的检疫和诊断。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ４７８９．２８—２００３ 食品微生物学检验 染色法、培养基和试剂ＧＢ１９４８９ 实验室 生物安全通用要求３ 生物安全措施试验环境和防护要求见ＧＢ１９４８９。４ 临床诊断４．１ 器材及消毒药物４．１．１ 器材：工作服、胶手套、线手套、防护面具、口罩、风镜、反光镜、手电筒、煮沸消毒器、脸盆、耳夹子。４．１．２ 消毒药物：０．１％升汞水、２．５％来苏、０．１％新洁尔灭、７５％酒精棉球等。４．２ 检查方法４．２．１ 检查者及助手均应穿工作服，戴好乳胶手套、口罩、风镜及防护面具，选择适当位置，对保定好的马进行检查。４．２．２ 检查皮肤、皮下组织及黏膜发生结节、脓肿、溃疡和淋巴管索状肿及串珠状结节。４．２．３ 检查结束，脱掉手套，检查者及助手的手需用０．１％升汞水或２．５％来苏或０．１％新洁尔灭或７５％酒精棉球彻底消毒，工作服及用过的器材分别用２．５％来苏尔等浸泡１ｈ，或煮沸１０ｍｉｎ消毒。检疫现场用１０％石灰乳、２％热火碱水或１０％～２０％漂白粉水溶液消毒。４．３ 临床特征４．３．１ 皮肤（皮下组织）结节、脓肿和溃疡：常见于四肢、头部（尤其是唇部），其次为颈、背、腰、尻、胸侧和腹侧。初为硬性无痛结节，随之软化形成脓肿，破溃后流出黄白色混有血液的脓汁，形成溃疡。继而愈合或形成瘘管。４．３．２ 黏膜结节：常侵害鼻腔黏膜，可见鼻腔有少量黏液脓性鼻漏，鼻黏膜上有大小不等黄白色结节，结节逐渐破溃形成溃疡，颌下淋巴结也多同时肿大。口唇、眼结膜及生殖道黏膜，公畜的包皮、阴囊、阴１犛犖／犜１４４９—２０１１茎和母畜的阴唇、会阴、乳房等处也可发生结节和溃疡。４．３．３ 淋巴管索状肿及串珠状结节：病菌引起淋巴管内膜炎和淋巴管周围炎，使之变粗变硬呈索状。因淋巴管瓣膜栓塞，在索状肿胀的淋巴管上形成许多串珠状结节，呈长时间硬肿，而后变软化脓，破溃后流出黄白色或淡红色脓液，形成蘑菇状溃疡。４．４ 判定根据临床特征（见４．３）可做出初步诊断。进一步确诊应采集病料或血清样品进行实验室检查。４．５ 鉴别诊断本病的皮肤型容易与鼻疽（鼻疽伯克霍尔德氏菌引起）、溃疡性淋巴管炎（假结核棒状杆菌引起）、孢子丝菌病（申克氏子孢子丝菌引起）和组织胞浆菌病（荚膜组织胞浆菌裹膜变种引起）相混淆（具体鉴别要点参见附录Ａ、附录Ｂ）。由于流行性淋巴管炎的临床症状易与其他疾病混淆，因此确诊有待于实验室诊断。５ 病原分离与鉴定５．１ 材料准备５．１．１ 器材微量移液器、恒温水浴箱、二氧化碳培养箱、普通冰箱及低温冰箱（４℃、－２０℃）、离心机及离心管、普通生物显微镜、暗视野或相差显微镜、组织切片机以及废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸。５．１．２ 培养基与试剂真菌琼脂、放线菌酮、氯霉素、固定液、软蜡（熔点为４５℃～５０℃）、硬蜡（熔点为５６℃～５８℃），无水乙醇、９５％酒精、７５％酒精。ＨＥ染色液、革兰氏染色液，按ＧＢ／Ｔ４７８９．２８—２００３中２．２规定配制。５．２ 样品采集和运送５．２．１ 样品采集从化脓灶和病变淋巴结无菌采集病料。作病原分离时，应将病料放入含抗生素的液体培养基中冷藏，最好尽快进行培养。直接检测时，用棉拭子采集病料后在载玻片上涂片并立即固定。病理组织学检查时，应将病变组织块（包括有病变的和病变周围的正常组织）放入１０％中性福尔马林缓冲液中。确诊本病有赖于发现荚膜组织胞浆菌假性皮疽变种。５．２．２ 样品运送在低温条件（２℃～８℃）下，样品尽快（２４ｈ～４８ｈ内）送往实验室。５．３ 病原分离培养取制备好的真菌琼脂培养基试管，无菌操作将采集的样品用接种棒勾取绿豆粒至黄豆粒大小的脓液，或切取结节（淋巴结组织）内壁小组织块，放置培养基斜面下三分之一处，每个样品接种２个试管。将接种好的试管置２８℃恒温培养，最初２４ｈ应检查是否有杂菌污染。４８ｈ后就每天观察，培养４ｄ～１５ｄ。若培养超过１０ｄ，向试管内加灭菌生理盐水，加入量不超过培养物为宜。２犛犖／犜１４４９—２０１１５．４ 病原鉴定５．４．１ 菌落鉴定２８℃恒温培养４８ｈ后应每天观察琼脂培养基。观察培养基上有无疑似特征性菌落。在培养基上形成干燥、黄色至暗褐色颗粒状皱缩的菌丝体形菌落。有时形成气生菌丝，但很少见。显微镜下观察培养的菌落，菌丝透明，分隔，呈分枝状，多形态（直径１μｍ～４μｍ）。５．４．２ 革兰氏染色鉴定５．４．２．１ 革兰氏染色按ＧＢ／Ｔ４７８９．２８—２００３中２．２规定操作。５．４．２．２ 结果判定：本菌为革兰氏阳性菌呈紫色。典型的酵母形菌体，多形态性，卵形至球形结构，直径约２μｍ～５μｍ，常单个散在或成丛，菌体周围常可见一晕环（未着色的荚膜）。５．４．３ 病理组织学鉴定５．４．３．１ 将采集的病料（２ｍｍ×２ｍｍ）浸入１０倍体积的固定液中固定６ｈ。５．４．３．２ 将固定好的组织块放入流水中漂洗２４ｈ。５．４．３．３ 放入下列不同浓度的酒精中脱水：７５％酒精２ｈ→８５％酒精２ｈ→９５％酒精Ⅰ２ｈ→９５％酒精Ⅱ２ｈ→１００％酒精Ⅰ２ｈ→１００％酒精Ⅱ２ｈ。５．４．３．４ 放入香柏油和二甲苯中透明：香柏油中１２ｈ→二甲苯Ⅰ１ｈ→二甲苯Ⅱ１ｈ。５．４．３．５ 浸蜡：软蜡中放置４０ｍｉｎ；硬蜡中放置２ｈ。５．４．３．６ 将浸好蜡的组织块放入包埋框中用硬蜡包埋，冷却过夜。５．４．３．７ 将石蜡块切成５μｍ厚的切片，用干净的载玻片贴片。５．４．３．８ 脱蜡：依次将切片放入二甲苯二甲苯二甲苯各１ｍｉｎ，无水乙醇无水乙醇７０％乙醇各５ｍｉｎ，然后用流水冲洗。５．４．３．９ 将切片置于蒸馏水中漂洗，浸入苏木素染色液５ｍｉｎ～１５ｍｉｎ。５．４．３．１０ 水洗玻片上多余染液，０．５％～１％盐酸酒精（７０％酒精配制）分色片刻。镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止，约数１０ｓ。５．４．３．１１ 流水冲洗１５ｍｉｎ～３０ｍｉｎ，或者在碳酸锂饱和液中短时间碱化或蓝化，即细胞核呈蓝色。５．４．３．１２ 蒸馏水短洗。５．４．３．１３ ０．１％～０．５％伊红染液染色１ｍｉｎ～５ｍｉｎ，若着色困难，可在每１００ｍＬ染液中加入１滴～２滴冰醋酸，使易着色且不易脱色。５．４．３．１４ 依次经７０％、８５％、９５％、１００％酒精脱水，各级为２ｍｉｎ～３ｍｉｎ，在９５％以下浓度的酒精中伊红易脱色，应适当缩短时间。５．４．３．１５ 二甲苯透明（２次），共约１０ｍｉｎ。５．４．３．１６ 封片：擦去切片周围多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固。５．４．３．１７ 显微镜检查：典型的病理变化为伴有纤维组织增生的化脓性肉芽肿炎症，常见有郎罕氏巨细胞，并可在细胞内、外发现大量的病原体；菌体呈多形性，常略似柠檬的嗜碱性团块，直径２μｍ～５μｍ；在巨噬细胞或巨细胞内，常能见到正在出芽的菌体。５．４．３．１８ 根据典型的病理变化（见５．４．３．１７）可做出病原学诊断。３犛犖／犜１４４９—２０１１６ 血清学鉴定技术６．１ 荧光抗体试验６．１．１ 试验器材恒温培养箱、荧光显微镜、载玻片、盖玻片、玻璃铅笔、接种环、镊子、染色缸。６．１．２ 试验材料标准抗原、荧光标记的标准阳性血清、标准阴性血清按说明书使用；异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）、磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）。试剂配制见附录Ｃ。６．１．３ 间接荧光抗体试验６．１．３．１ 病料采集及保存按５．２操作。６．１．３．２ 制备抗原片，取病料在载玻片上涂片或用盐水将培养的酵母样菌体乳化制成薄的涂片。６．１．３．３ 将涂片通过火焰固定。６．１．３．４ 用ＰＢＳ浸洗１ｍｉｎ。６．１．３．５ 加未稀释的被检血清（见附录Ｄ），在３７℃湿盒中温育３０ｍｉｎ。６．１．３．６ 用ＰＢＳ浸洗３次，每次１０ｍｉｎ。６．１．３．７ 加入工作浓度的异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）标记抗马抗体，在３７℃湿盒中温育３０ｍｉｎ。６．１．３．８ 用ＰＢＳ浸洗３次，每次１０ｍｉｎ。６．１．３．９ 用荧光显微镜检查。６．１．３．１０ 结果判定：将载玻片放在荧光显微镜载物台上，调好光源即可观察。阳性反应者ＦＩＴＣ荧光色素呈明亮的黄绿色荧光。阴性反应则没有相应的荧光出现。根据间接荧光抗体试验结果可判定为血清学阳性。６．１．４ 直接荧光抗体试验６．１．４．１ 先将被检血清中的球蛋白沉淀，然后用盐水将沉淀悬浮并恢复到原体积，最后将血清用ＦＩＴＣ标记。６．１．４．２ 载玻片上滴加１滴～２滴生理盐水，取少量培养的菌丝体菌落颗粒悬浮其中，另取一玻片压碎菌落颗粒，从玻片一端拖涂液体制成薄片。６．１．４．３ 涂片加热固定。６．１．４．４ 用ＰＢＳ冲洗。６．１．４．５ 滴加标记血清稀释液，在３７℃湿盒中温育６０ｍｉｎ。６．１．４．６ ＰＢＳ冲洗３次，每次５ｍｉｎ。６．１．４．７ 荧光显微镜下观察。６．１．４．８ 结果判定：将载玻片放在荧光显微镜载物台上，调好光源即可观察。阳性反应者ＦＩＴＣ荧光色素呈明亮的黄绿色荧光。阴性反应则没有相应的荧光出现。根据直接荧光抗体试验结果可判定为血清学阳性。６．２ 酶联免疫吸附试验６．２．１ 器材酶标板、可调移液器、恒温培养箱、电子天平、酶标仪。４犛犖／犜１４４９—２０１１６．２．２ 试剂抗原、阴性血清、阳性血清、酶标抗体、包被缓冲液、洗涤缓冲液、稀释液、底物缓冲液（使用前配制）、终止液。６．２．３ 操作方法６．２．３．１ 用真菌琼脂试管接种菌丝体菌体，于２６℃下培养４周，取３个菌落加５０ｍＬ无菌ＰＢＳ研碎，稀释成１∶１００悬液，以每孔１００μＬ量包被酶标板，放置４℃过夜温育。６．２．３．２ 用洗涤液洗涤酶标板３次，每次３ｍｉｎ。６．２．３．３ 每孔加入１００μＬ封闭液，于２３℃～２５℃轻轻振荡在湿盒中温育３０ｍｉｎ。６．２．３．４ 用洗涤液洗板３次，每次３ｍｉｎ。６．２．３．５ 将待检血清（见附录Ｅ）用稀释液１∶４０稀释，加入１００μＬ，将酶标板置湿盒中３７℃振荡温育１ｈ。每个血清稀释度做２个平行对照，同时设阳性血清对照和阴性血清对照。６．２．３．６ 用洗涤液洗板３次，每次３ｍｉｎ。６．２．３．７ 取１∶８００倍稀释的过氧化物酶标记的山羊抗马ＩｇＧ，每孔加入１００μＬ，于２３℃～２５℃轻轻振荡温育３０ｍｉｎ。６．２．３．８ 用洗涤液洗板３次，每次３ｍｉｎ。６．２．３．９ 每孔加入１００μＬ用底物溶液，温育６０ｍｉｎ。６．２．３．１０ 每孔加入１００μＬ终止液，用酶标仪在波长４０５ｎｍ处判读结果。６．２．４ 结果判定６．２．４．１ 结果计算见式（１）：犛／犘＝（犛ＯＤ－犖犆ｘ）／（犘犆ｘ－犖犆ｘ）…………