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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜１４５４—２０１１代替ＳＮ／Ｔ１４５４—２００４马立克氏病检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉犕犪狉犲犽’狊犱犻狊犲犪狊犲２０１１０５３１发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ１４５４—２００４《鸡马立克氏病病毒分离与鉴定方法》。本标准与ＳＮ／Ｔ１４５４—２００４相比，主要技术变化如下：———加入了临床诊断内容；———琼脂免疫扩散实验的内容。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国陕西出入境检验检疫局、中华人民共和国山西出入境检验检疫局。本标准主要起草人：马玉玲、蒋宏伟、陈茂盛、巩红霞、米敬斌、高建新。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ１４５４—２００４。Ⅰ犛犖／犜１４５４—２０１１马立克氏病检疫技术规范１ 范围本标准规定了马立克氏病的检疫技术要求。本标准适用于马立克氏病的流行病学调查和口岸检疫。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 缩略语下列缩略语适用于本文件。ＭＤ（ｍａｒｅｋ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）：马立克氏病ＭＤＶ（ＭＤｖｉｒｕｓ）：马立克氏病病毒ＣＥＦ（ｃｈｉｃｋｅｍｂｒｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）：鸡胚成纤维细胞ＤＥＦ（ｄｕｃｋｅｍｂｒｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）：鸭胚成纤维细胞ＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃｐａｔｈｏｇｅｎｆｒｅｅ）：无特定病原体动物ＣＰＥ（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆｆｅｃｔ）：细胞病变４ 临床诊断与判定标准４．１ 特征性发病症状在鸡群中，临床症状表现为步态不稳、共济失调，一肢或多肢的麻痹或瘫痪，并且两腿前后伸展呈“劈叉”姿势时，一般可作为ＭＤ的示病症状，可初步判定为ＭＤ。４．２ 特征性病理变化４．２．１ 神经型的病理变化为腰荐神经丛、坐骨神经丛、臂神经丛、颈部迷走神经丛等部位肿胀，呈半透明水肿样，色泽变淡，横纹消失，其肿胀程度一般为正常神经的２倍～３倍，且多为不对称性，通过比较对侧神经将有助于判定。４．２．２ 皮肤型的病理变化为以皮肤的羽毛囊为中心，形成半球形隆起的肿瘤，其表面有时可见鳞片状棕色痂皮。４．２．３ 眼睛特征性病理变化是淋巴细胞浸润虹膜而导致的病理变化，虹膜呈环状或斑点状褪色，出现淡灰色；瞳孔不规则，有时偏向虹膜一侧。１犛犖／犜１４５４—２０１１５ 实验室诊断５．１ 琼脂免疫扩散试验（犃犌犐犇）５．１．１ 器材和试剂５．１．１．１ 孔径４ｍｍ打孔器、直径９０ｍｍ平皿、５μＬ～５０μＬ微量移液器和微量吸头、量桶、吸管等。５．１．１．２ １％硫柳汞溶液：硫柳汞１ｇ，蒸馏水１００ｍＬ，溶解后置玻璃瓶盖塞备用。５．１．１．３ ０．０１ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ｐＨ７．４）：配制见附录Ａ。实验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２要求。５．１．１．４ 抗原和标准阳性血清：由指定单位提供，按说明书使用。５．１．１．５ 琼脂板的制备：在２５０ｍＬ容量的三角瓶中分别加入ｐＨ７．４磷酸盐缓冲液１００ｍＬ、琼脂糖１ｇ、氯化钠８ｇ。将三角瓶在水浴中煮沸使琼脂糖充分融化，再加入１％硫柳汞１ｍＬ，混合均匀，冷却至４５℃～５０℃，将洁净干热灭菌的直径为９０ｍｍ的平皿置于平台上，每个平皿加入１８ｍＬ～２０ｍＬ。加盖待凝固后，把平皿倒置以防水分蒸发，放冰箱４℃中冷藏保存备用（时间不超过２周）。５．１．２ 样品的采集５．１．２．１ 被检鸡的羽髓液：选拔含羽髓丰满的翅羽或身体其他部位的大羽数根剪下羽根部分，并按编号分别收集于相应的小试管内，向管内滴加２滴～３滴蒸馏水（羽髓丰满时也可不加），然后用玻璃棒挤压羽根，以适当的力转动玻璃棒即成。５．１．２．２ 被检血清：按常规方法采血分离血清。无溶血，无细菌污染。５．１．３ 操作方法５．１．３．１ 抗体检测５．１．３．１．１ 打孔：反应孔现用现打。在已制备好的琼脂板上，按图１打孔，孔径４ｍｍ，孔间距４ｍｍ，将孔中的琼脂用７号针头斜面向上从右侧边插入，轻轻向左侧方向挑出，勿损坏孔的边缘，避免琼脂脱离底部。用酒精灯火焰轻烤平皿底部至琼脂轻微熔化为止达到封闭孔的底部，以防样品溶液侧漏。图１ 打孔示意图５．１．３．１．２ 加样：在制备好的琼脂板中的①、③、⑤孔中用微量移液器加入各被检血清样品，在②、④、⑥孔内加阳性血清，在中心孔⑦加入标准抗原，每孔均以加满与琼脂表面形成一个平面为度，每加一个样品应换一个吸头。５．１．３．１．３ 感作：加样完毕后，加上平皿盖，放入底面放置有湿纱布的带盖平底盒中，置３７℃温箱中反应，分别在２４ｈ和４８ｈ观察结果。５．１．３．２ 抗原检测操作方法同５．１．３．１，加样如下：将病鸡羽髓液按顺序分别加到②③⑤⑥孔内，用微量移液器吸取２犛犖／犜１４５４—２０１１标准抗原分别加入①、④孔中，取标准阳性血清加到⑦孔内，每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个吸头。５．１．４ 结果判定及判定标准５．１．４．１ 阳性将琼脂板置侧强光下进行观察，被检样品孔与中心孔之间形成清晰的沉淀线，并与周边已知抗原和阳性血清孔之间的沉淀线相互融合。５．１．４．２ 弱阳性被检样品孔与中心孔之间不出现沉淀线，而标准阳性血清与标准抗原孔之间所产生的沉淀线末端弯向被检样品孔内侧。５．１．４．３ 阴性被检样品孔与中心孔之间不出现沉淀线，标准阳性血清与标准抗原孔的沉淀线的末端向毗邻的待检样品孔直伸或向外侧偏弯曲。５．１．４．４ 可疑介于阴性与阳性之间为可疑。可疑应重检，仍为可疑判为阳性。５．２ 病毒分离和鉴定５．２．１ 试剂和材料５．２．１．１ １日龄雏鸡：用ＳＰＦ种蛋孵化。５．２．１．２ 溶液及细胞培养液的制备：见附录Ａ。５．２．１．３ 淋巴细胞分层液：由指定单位提供，按说明书使用。５．２．１．４ 标准ＭＤＶ分型单克隆抗体及兔抗鼠免疫荧光抗体：由指定单位提供，按说明书使用。５．２．２ 操作步骤５．２．２．１ 犇犈犉（犆犈犉）的制备５．２．２．１．１ 将ＳＰＦ鸭种蛋孵化至１２ｄ～１４ｄ（ＳＰＦ种鸡蛋孵化至９ｄ～１０ｄ）。５．２．２．１．２ 用碘酊和７５％酒精消毒外壳，打开气室，用灭菌镊子取出胚体，置于灭菌平皿，除去头、趾和内脏。将躯干用预冷的Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液冲洗三次，剪碎。５．２．２．１．３ 用预冷的Ｈａｎｋｓ的平衡盐液尽可能地洗净组织碎块中的血液，再用胰蛋白酶溶液冲洗一次，然后加入２０ｍＬ～５０ｍＬ的胰蛋白酶溶液，通过磁力搅拌均匀，在３７℃水浴中消化１５ｍｉｎ。５．２．２．１．４ 通过双层消毒纱布过滤细胞悬浮液，将滤液收集于灭菌离心管，以１０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃去上清液，加入预冷的Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液用同样的离心方法洗涤两次。５．２．２．１．５ 弃去上清液，每１ｍＬ细胞沉淀加入细胞生长液９ｍＬ制成１０％的悬浮液，再用细胞生长液做１∶４０稀释，分装于细胞培养瓶中，３７℃培养４８ｈ即可作鸭胚（鸡胚）成纤维细胞使用。５．２．２．２ 样品的采集与处理挑选临床发病的ＭＤ疑似病鸡，每只鸡无菌采集枸橼酸钠抗凝全血５ｍＬ～１０ｍＬ，加入淋巴细胞分层液，１１００ｒ／ｍｉｎ离心２５ｍｉｎ，分离收集淋巴细胞，并用无菌磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）洗涤两次，用细胞３犛犖／犜１４５４—２０１１维持液稀释成１０７个／ｍＬ淋巴细胞的细胞悬浮液直接使用或者加入１５％的二甲基亚砜后保存在液氮（－１９６℃）中备用。５．２．２．３ 接种和培养取生长良好的ＤＥＦ单层，弃去维持液，接种０．２ｍＬ处理好的淋巴细胞悬浮液，置含５％二氧化碳的培养箱，３７℃下吸附１．５ｈ。补充适量维持液继续培养，２４ｈ内换液一次，以后每２ｄ～３ｄ换液一次。在培养过程中每日观察ＣＰＥ产生情况，同时设立不接种样品的空白细胞对照瓶。５．２．２．４ 收集在空白细胞对照瓶的细胞生长良好的前提下，将产生广泛ＣＰＥ（蚀斑形成面积占３０％以上）的ＤＥＦ单层培养瓶中的维持液弃去，用０．０１％胰酶消化，加细胞生长液制成细胞悬浮液直接供鉴定用，或者加二甲基亚砜后置液氮（－１９６℃）中保存备用。５．２．３ 鉴定５．２．３．１ 电境观察将ＭＤＶ分离物按照常规方法制成超薄切片，用电子显微镜观察病毒的形态和大小。５．２．３．２ 蚀斑测定用ＭＤＶ分离物接种ＣＥＦ次代单层，培养至７２ｈ，用测微器测量蚀斑大小，每份分离物至少测量１０个蚀斑，取其平均值作为蚀斑大小的测定值。５．２．３．３ 间接免疫荧光试验将出现ＣＰＥ的病毒分离物接种到带生长成单层细胞盖玻片的细胞管内，３７℃下吸附１．５ｈ。补充适量维持液，置二氧化碳培养箱中培养观察。当出现明显的病毒蚀斑时，取出管内盖玻片，以冷甲醇（－２０℃）在４℃条件下固定１５ｍｉｎ，然后用ＰＢＳ冲洗三次（每次５ｍｉｎ），滴加ＭＤＶ分型单克隆抗体，置湿盒３７℃感作９０ｍｉｎ～１２０ｍｉｎ，用ＰＢＳ冲洗三次（每次５ｍｉｎ），滴加抗鼠免疫荧光抗体，置湿盒３７℃水浴感作３０ｍｉｎ，用含０．０５％吐温２０的ＰＢＳ冲洗三次（每次５ｍｉｎ），然后用荧光显微镜检查细胞内荧光出现情况。５．２．４ 结果判定５．２．４．１ ＭＤＶ在电子显微镜下观察时，可见到直径为８５ｎｍ～１００ｎｍ近似圆形或者六角形的病毒颗粒或者核衣壳，多数出现在感染的细胞核中，偶见于细胞浆中。５．２．４．２ ＭＤＶ病毒可以在ＤＥＦ或者ＣＥＦ单层上产生蚀斑，蚀斑大小一般在１ｍｍ之内。血清Ⅰ型产生的蚀斑较小，血清Ⅱ型产生大合胞体的中等蚀斑，血清Ⅲ型产生大的蚀斑。５．２．４．３ 经标准ＭＤＶ分型单克隆抗体间接免疫荧光染色，在荧光显微镜下病变细胞的核和胞浆中出现清晰闪亮的黄绿色荧光，根据出现荧光的感染细胞所使用的单克隆抗体，可以确定ＭＤＶ分离毒株为相应的血清型。４犛犖／犜１４５４—２０１１附 录 犃（规范性附录）溶液的配制犃．１ 狆犎７．４０．０１犿狅犾／犔磷酸盐缓冲液的配制磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２Ｏ） ２．９ｇ磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）０．３ｇ氯化钠（ＮａＣｌ）８．０ｇ将上述试剂依次加入容器中，用无离子水或蒸馏水溶至１０００ｍＬ。犃．２ 细胞培养液的制备犃．２．１ Ｈａｎｋｓ平衡溶液的配制：Ａ液氯化钠（ＮａＣｌ） ８０．０ｇ氯化钾（ＫＣｌ）４．０ｇ硫酸镁（ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ４）１．０ｇ氯化镁（ＭｇＣｌ２·６Ｈ２Ｏ）１．０ｇ双蒸水８００．０ｍＬＢ液氯化钙（ＣａＣｌ２）１．４ｇ葡萄糖１０．０ｇ双蒸水２００．０ｍＬ犃．２．２ 按照上列顺序分别称量Ａ、Ｂ液的各试剂，溶解于双蒸水。犃．２．３ 将Ａ液和Ｂ液分别于０．０６９ＭＰａ～０．０７５ＭＰａ压力下高压灭菌１０ｍｉｎ或过滤除菌。冷却后，将Ｂ液缓慢加入到Ａ液，持续搅拌使之混匀。犃．２．４ 分装于１００ｍＬ～５００ｍＬ灭菌瓶中，密封盖紧塞子。贮存４℃或室温下。犃．３ 细胞生长液的配制犃．３．１ 顺序无菌称量以下试剂：５％水解乳蛋白溶液１０．０ｍＬＨａｎｋｓ平衡盐溶液９．５ｍＬ犊牛血清５．０ｍＬ青霉素１．０ｍＬ链霉素０．５ｍＬ碳酸氢钠［（ＮａＨＣＯ３（７．５％）］１．０ｍＬ犃．３．２ 将上述试剂溶入７２．５ｍＬ双蒸水中，并用双蒸水调节总量至１００ｍＬ，充分混匀。５犛犖／犜１４５４—２０１１犃．４ 细胞维持液的配制方法同细胞生长液的配制，只需将犊牛血清含量调整为１ｍＬ～２ｍＬ即可。犃．５ 狆犎７．０磷酸盐缓冲液（犘犅犛）的配制犃．５．１ 所需试剂的准备：Ａ液氯化钠（ＮａＣｌ） ８．０ｇ氯化钾（ＫＣｌ） ０．２ｇ氯化钙（ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ）０．１３２ｇ氯化镁（ＭｇＣｌ２·２Ｈ２Ｏ）０．１ｇ双蒸水８００．０ｍＬＢ液磷酸氢二钠（Ｎａ２ＨＰＯ４）１．１５ｇ磷酸二氢钾（ＫＨ２ＰＯ４）０．２ｇ双蒸水２００ｍＬ犃．５．２ 依次分别称量各试剂，溶解于双蒸水。犃．５．３ 以０．１０４ＭＰａ～０