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牛病毒性腹泻／粘膜病病毒微量血清中和试验操作规程Protocolofserumneutralizationmicrotestforbovineviraldiarrhea／mucosaldiseaseSN／T1129.1—2002前 言 本标准试验方法是参考国际兽疫局《诊断试验和疫苗标准手册》介绍的方法，并经过长期实践、改进，使之进一步具体化，而形成现行的标准。 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国云南出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：张晓丁、苏卫、王涛、李凌枫。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1范围 本标准规定了牛病毒性腹泻／粘膜病微量血清中和试验方法。 本标准适用于动物牛病毒性腹泻／粘膜病中和抗体的检测。2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期时引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB／T6682～1992分析实验室用水规格和实验方法3缩略语 下列缩略语适用于本标准。 CPE细胞病变作用。 TCID50半数组织培养感染量。 BVD／MD牛病毒性腹泻／粘膜病。4原理 动物感染BVD后，能在体内产生特异性中和抗体。这种特异性中和抗体与病毒结合后，能使病毒失去对敏感细胞的感染能力，从而阻止病毒的繁殖。这一反应不但表现为一种病毒只能被相应的免疫血清所中和，而且还表现中和一定数量的病毒，必须有一定效价的免疫血清。血清中和试验以测定病毒的感染力为基础，中和抗体滴度的判定以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，所以必须选用对病毒敏感的细胞为实验材料，以保证实验的准确性和敏感性。5试剂和材料5.1水 本标准所用水应符合GB／T6682—1992中二级水的规格。5.2病毒 BVD病毒OregonC24V株。5.3对照血清5.4被检血清 在无菌条件下采取血样，分离血清。5.5细胞 试验所用的细胞为牛鼻甲骨传代细胞(BT)、胎牛(或犊牛)鼻甲骨原代细胞、牛肾传代细胞(MDBK)、胎牛(或犊牛)肾原代细胞、胎牛或犊牛睾丸细胞。按常规胰酶消化方法制备(所用犊牛应无BVD污染)。5.6本标准所用溶液 配方(包括培养液、维持液、稀释液、细胞分散液)及配制方法见附录A。6器械和设备6.1倒置光学显微镜6.2微型振荡器6.3二氧化碳培养箱6.4冰箱：-20℃保存血清，-70℃保存种毒。6.596孔组织培养板6.6单头和多头微量移液器(20μL～200μL)及滴头7种毒繁殖 将BVD病毒OregonC24V株接种到细胞单层，37℃吸附1h后加入维持液，置37℃培养，逐日观察。待CPE达75％以上，收获病毒培养物冻融，2000r／min离心20min。取上清液分装小瓶，每瓶1mL，置-70℃保存备用。8毒价测定 将病毒在96孔板上作(100～10-10)倍稀释，每个稀释度接种8孔，每孔病毒悬液为50μL，补充50μL稀释液，加入细胞悬液100μL(3×105个细胞／mL)，每块板设8孔细胞对照。置5％C02培养箱于37℃培养，于4d～6d逐日在倒置显微镜下观察记录CPE。按Karber方法计算出病毒的TCID50／50μL值。根据测定结果将病毒液稀释成100TCID50／50μL的工作浓度。9试验程序9.1灭活 BVD标准阳性血清、阴性血清、被检血清经56℃，30min灭活。9.2对照设立 —细胞对照：设4孔正常细胞对照，每孔加细胞悬液100μL、稀释液100μL。 —病毒回归对照：将工作浓度的病毒液进一步10倍稀释成100、10、1、0.1TCID50／50μL，每个稀释度接种2孔，每孔加入病毒悬液50μL，再加入细胞悬液100μL，每孔补充稀释液50μL。 —阳性对照：设4孔阳性血清对照，每孔分别加入阳性血清和100TCID50／50μL病毒悬液各50μL，再加入细胞悬液100μL。 —阴性对照：设阴性血清对照4孔，每孔分别加入阴性血清和100TCID50／50μL病毒悬液各50μL，再加入细胞悬液100μL。 —血清毒性对照：每份被检血清按稀释度各设1孔毒性对照，每孔加各稀释度血清50μL、稀释液50μL和细胞悬液100μL。9.3中和试验 根据试验需要，将被检血清从1：2开始作倍比系列稀释，每个稀释度加三孔，每孔加已稀释血清50μL，第一孔作为血清毒性对照孔，加入稀释液50μL和细胞悬液100μL；第二、三孔为试验孔，每孔加入100TCID5。／50μL的病毒悬液50μL，振荡2min～3min，置37℃二氧化碳培养箱中和lh，然后加入细胞悬液100μL。置5％二氧化碳培养箱于37℃培养6d，逐日观察CPE并记录。10结果判定 当病毒对照滴度为100(30～300)TCID50／50μL时，阳性血清能完全抑制BVD病毒的CPE，阴性血清完全不能抑制BVD病毒的CPE，细胞对照孔和血清毒性对照孔内的细胞生长正常时，才能进行结果判定。判定时间为4d～6d，逐日记录CPE。当被检血清的某一稀释度出现50％以上被保护时，该血清的稀释度即为该份血清的中和抗体滴度。附 录 A(规范性附录)溶液配制A.1培养液 199培养基(也可用MEM或其他培养基)，加入10％无BVD病毒抗体胎牛血清(56℃，30min灭活)，含青霉素200IU／mL，链霉素200μg／mL，抽滤除菌。置-20℃保存备用。A.2维持液 199培养基(也可用MEM或其他培养基)，加入2％无BVD病毒抗体胎牛血清(56℃，30min灭活)，含青霉素200IU／mL，链霉素200μg／mL，抽滤除菌。置-20℃保存备用。A.3细胞分散液 胰酶 2.50g 乙二胺四乙酸二钠(EDTA) 0.20g 无钙镁离子PBS液 1000mL 抽滤除菌分装，置-20℃保存备用。A.4无钙镁PBS 氯化钠 8.0g 氯化钾 0.2g 磷酸氢二钠 1.15g 磷酸二氢钠 0.2g 水 1000mL 将上述成分依次溶解、分装、高压灭菌(68.94kPa15min)或抽滤除菌，置4℃保存备用，有效期为一年。A.5Hank's液A.5.110倍Hank's母液的制备 A液：氯化钠 80.0g 氯化钾 4.0g 氯化钙 1.4g 硫酸镁(7H20) 2.0g 水 450mL B液：磷酸氢二钠 0.6g 磷酸二氢钾 0.6g 水 450mL C液：1％酚红 16mL 将上述成分依次溶解，将B液慢慢加到A液中，同时不断搅拌，再加入C液，补充水至1000mL。抽滤除菌或高压灭菌(103.41kPa10min)。置4℃保存备用，有效期为3个月。A.5.2Hank's使用液的制备 10倍Hank's母液 500mL 一级水 4500mL 将母液加到水中，摇匀分装。抽滤除菌或高压灭菌(103.41kPa10min)。置4℃保存备用，有效期为3个月。使用前每1000mL加1.4％碳酸氢钠25mL。A.61.4％碳酸氢钠溶液 碳酸氢钠 14.0g 一级水 1000mL 分装抽滤除菌，置-20℃保存备用，有效期为6个月。A.71％酚红 酚红 1.0g 1mol/LNaOH 约7mL 水 总量到100mL 将酚红放于乳钵内加少量1mol／L氢氧化钠研磨使其完全溶解，氢氧化钠加得越少越好，分装高压灭菌(68.94kPa10min)，置室温或4℃保存备用。A.8消化液(0.25％胰酶Trypsin) 胰酶 2.5g Hank's使用液 1000mL 分装抽滤除菌，置-20℃保存备用。