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出口肉及肉制品中卡巴氧残留量检验方法 气相色谱法Methodforthedeterminationofcarbadoxresiduesinmeatsandmeatproductsforexport—GaschromatographySN/T1016.1—2001前 言 本标准是按照GB/T1.1—1993《标准化工作导则第1单元：标准的起草与表述规则第1部分：标准编写的基本规定》及SN/T0001—1995《出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定》的要求编写的，其中测定方法是参考国内外有关文献，经研究、改进和验证后制定的。本标准同时制定了抽样和制样方法。 测定低限是根据国际上对肉及肉制品中卡巴氧及其代谢物残留量的最高限量和测定方法的灵敏度而制定的。 本标准的附录A是提示的附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国浙江出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：郑自强、唐红芳、朱晓雨、朱宏、丁慧瑛。 本标准首次发布。1范围 本标准规定了出口肉及肉制品中卡巴氧残留量检验的抽样、制样和气相色谱测定方法。 本标准适用于出口猪肉中卡巴氧代谢物(喹喔啉-2-羧酸)残留量的检验。2抽样和制样2.1检验批 以不超过2500件为一检验批。 同一检验批的商品应具有相同的特征。如包装、标记、产地、规格和等级。2.2抽样数量2.3抽样方法 按2.2规定的抽样件数随机抽取，逐件开启。每件中取一袋作为原始样品，其总量不少于2kg。放入清洁容器内，加封后，标明标记，及时送交实验室。如每件中无小包，或有小包装但每袋质量超过2kg者，可用灭菌锋利刀在抽出的包件中，每件割取不少于100g，混合后置于洁净容器内，作为混合原始样。混合原始样的质量不少于2kg。加封后，标明标记，及时送交实验室。2.4试样制备 从所取全部样品中取出有代表性样品约1kg，取可食部分经捣碎机充分捣碎均匀，均分成两份，分别装入洁净容器内作为试样。密封并标明标记。2.5试样保存 将试样于-18℃以下冷冻保存。 注：在抽样和制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。3测定方法批量/件最低抽样数/件1～25126～1005101～25010251～50015501～1000171001～2500203.1方法提要 用碱水解法将卡巴氧代谢物［喹喔啉-2-羧酸(QCA)］从样品中分离出来，接着用乙酸乙酯抽提并用pH6.0缓冲液反抽提，用离子排斥色谱法分离。用乙酸乙酯抽提柱洗脱液，浓缩提取液，用甲醇化的硫酸使QCA衍生化，所得甲酯衍生物经再抽提后用电子俘获气相色谱法测定，外标法定量。3.2试剂和材料 除另有规定外，试剂均为分析纯，水为蒸馏水。3.2.1甲醇。3.2.2浓硫酸。3.2.3乙酸乙酯。3.2.4柠檬酸：C6Ｈ8Ｏ7·Ｈ2Ｏ。3.2.5氢氧化钠。3.2.6浓盐酸。3.2.7盐酸溶液：1mol/L，用水稀释83.3mL浓盐酸至1000mL。3.2.8氢氧化钠溶液：3mol/L，溶解120g氢氧化钠于适量水中并稀释至1000mL。3.2.9柠檬酸溶液：1mol/L，溶解21.0g柠檬酸一水合物于1000mL水中。3.2.10柠檬酸缓冲液(pH6.0)：0.5mol/L，用5mol/L氢氧化钠溶液(约5.5mL)调节100mL1mol/L柠檬酸溶液至pH6.0，加水到200mL。3.2.11甲醇-水(10+90)：用水稀释10mL甲醇至100mL。3.2.12甲醇-硫酸(97+3)：用经无水硫酸钠干燥过的甲醇稀释3.0mL浓硫酸至100mL。当天制备，在加入酸以前将甲醇用冰浴冷却。3.2.13无水硫酸钠：650℃灼烧4h，置于干燥器中备用。3.2.14AGMP-50树脂：100目～200目。3.2.15喹喔啉-2-羧酸(QCA)标准品：已知纯度≥97%。3.2.16喹喔啉-2-羧酸标准溶液：准确称取适量的喹喔啉-2-羧酸标准品，用甲醇配成浓度为100μｇ/mL喹喔啉-2-羧酸的标准储备液，根据需要再用甲醇稀释储备液，配成适当浓度的标准工作液。3.3仪器和设备3.3.1气相色谱仪：配有电子俘获检测器。3.3.2组织捣碎机。3.3.3离心机。3.3.4分液漏斗：125mL。3.3.5旋转蒸发器，具温控水浴。3.3.6浓缩瓶：250mL。3.3.7锥形瓶：150mL。3.3.8离心管：具塞，10mL、25mL。3.3.9离子排斥柱：25cm×10mm(id)玻璃柱，下端垫一小团玻璃棉。将7.0gAGMP-50(100目～200目)树脂于1mol/L盐酸中调成浆，并将其移入柱中，用一根玻璃棒将柱子装填至10cm高，并用玻璃棉盖住树脂床。保持液面在树脂的上面。3.4测定步骤3.4.1提取和净化 称取约5g样品(精确到0.1g)于150mL三角瓶中，加10.0mL3mol/L氢氧化钠溶液，松松加塞，将其置于100℃水浴中，加热30min，浴中水浴面应高于组织试样。 将碱性水解产物于冰浴中冷却，用4mL浓盐酸酸化至pH≤1(至酸碱试纸呈深红色)。于酸化的水解产物中加30mL乙酸乙酯，加塞，振摇提取30s，静置分层，将上层液体滤入一125mL分液漏斗中。待分层后，将下层水相放回样品瓶中，再加20mL乙酸乙酯，加塞，振摇提取30s，静置分层，将上层液体并入分液漏斗中。静置分层，弃去水相。 于乙酸乙酯提取液中加5mL0.5mol/L柠檬酸缓冲液(pH6.0)，振摇，放置使下层清晰(10min)。将水相收集于25mL具塞离心管中。另用5mLpH6.0的缓冲液再提取乙酸乙酯相一次。使水相清晰，合并水提取液于同一离心管中，加2mL浓盐酸，混匀，供下述柱层析分离用。 将酸化的水提取液移入离子排斥柱中。放出提取液使液面至树脂床顶部。用20mL1mol/L盐酸淋洗离心管和树脂，经柱放出。另用20mL1mol/L盐酸再淋洗柱子，弃去流出液。用75mL甲醇-水(10+90)洗脱，此时可将柱子放净，收集洗脱液并转入一125mL分液漏斗中。流出液的流速约为1.2mL/min。 洗脱液中加1.0mL浓盐酸，用3×50mL乙酸乙酯提取。收集乙酸乙酯提取液于250mL圆底烧瓶中，于50℃水浴旋转蒸发器中蒸发至干。3.4.2酯化 用3mL甲醇将残渣洗入10mL离心管中，在60℃水浴氮气流下吹干。加0.2mL新鲜配制的甲醇-硫酸(97+3)，加塞，于55℃～60℃水浴中保温30min。取出，加1.0mL正己烷涡旋混匀30s，离心(2000r/min)5min，取0.1mL正己烷溶液稀释到1.0mL，供气相色谱测定。3.4.3标准物酯化 吸取1.0mL喹喔啉-2-羧酸标准工作液置于10mL离心管中，在60℃水浴氮气流下吹干。加0.2mL新鲜配制的甲醇-硫酸(97+3)，加塞，于55℃～60℃水浴中保温30min。提取和稀释(1∶10)的操作均按3.4.2步骤进行。酯化标准与酯化样品应同时进行。3.4.4测定3.4.4.1色谱条件 a)色谱柱：HP-5，15m×0.53mm(id)×1.5μｍ熔融石英毛细管柱或相当的色谱柱； b)柱温：170℃（８ｍｉｎ）10℃／ｍｉｎ200℃(10min)； c)进样口温度：250℃； d)检测器温度：280℃； e)载气、尾吹气：氮气(纯度≥99.999%)；载气流速：6mL/min；尾吹气流速：40mL/min； f)进样方式：填充柱进样口进样； g)进样量：2μL。3.4.4.2色谱测定 根据样液中喹喔啉-2-羧酸含量的情况，选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中喹喔啉-2-羧酸甲酯的响应值均应在仪器检测的线性范围内。标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下喹喔啉-2-羧酸甲酯的保留时间约为4min。标准品的色谱图见附录A中图A1。3.4.5空白试验 除不加试样外，均按上述操作步骤进行。3.4.6结果计算和表述 用色谱数据处理机或按式(1)计算试样中卡巴氧代谢物(喹喔啉-2-羧酸)的残留含量：…………………(1)式中：X——试样中卡巴氧代谢物(喹喔啉-2-羧酸)的残留含量，mg/kg； A——样液中喹喔啉-2-羧酸甲酯的峰面积，mm2； As——标准工作液中喹喔啉-2-羧酸甲酯的峰面积，mm2； c——标准工作液中喹喔啉-2-羧酸的浓度，μｇ／ｍＬ； V——样液最终定容体积，mL； m——最终样液所代表的试样质量，g。 注：计算结果需扣除空白值。4测定低限和回收率4.1测定低限 本方法的测定低限为0.03mg/kg。4.2回收率 猪肉中喹喔啉-2-羧酸添加浓度及其回收率的试验数据： 在0.03mg/kg添加水平时，回收率为98.3%； 在0.10mg/kg添加水平时，回收率为93.6%； 在0.30mg/kg添加水平时，回收率为93.4%。附录Ａ（提示的附录）标准品色谱图 图A1喹喔啉-2-羧酸标准品衍生物的气相色谱图