搜索
书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜０７６４—２０１１代替ＳＮ／Ｔ０７６４—１９９９，ＳＮ／Ｔ１１０９—２００２，ＳＮ／Ｔ１１１０—２００２，ＳＮ／Ｔ１６８６—２００５新城疫检疫技术规范犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾犳狅狉狀犲狑犮犪狊狋犾犲犱犻狊犲犪狊犲２０１１０５２０发布２０１１１２０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ／Ｔ０７６４—１９９９《出口家禽新城疫病毒检验方法》、ＳＮ／Ｔ１６８６—２００５《新城疫病毒中强毒株检测方法荧光ＲＴＰＣＲ法》、ＳＮ／Ｔ１１０９—２００２《新城疫微量红细胞凝集抑制试验操作规程》和ＳＮ／Ｔ１１１０—２００２《新城疫病毒分离及鉴定方法》。本标准与ＳＮ／Ｔ０７６４—１９９９、ＳＮ／Ｔ１１０９—２００２、ＳＮ／Ｔ１１１０—２００２和ＳＮ／Ｔ１６８６—２００５相比，主要技术变化如下：———增加了临床诊断；———增加了反转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）；———删除了毒力测定的鸡胚平均致死时间（ＭＤＴ）和静脉致病指数（ＩＶＰＩ）。本标准修改采用ＯＩＥ《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（２００９版）（ＭａｎｕａｌｏｆＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＴｅｓｔｓａｎｄＶａｃｃｉｎｅｓｆｏｒＴｅｒｒｅｓｔｒｉａｌＡｎｉｍａｌｓ）中第２．３．１４章。本标准与ＯＩＥ第２．３．１４章相比，主要技术差异如下：———本标准完全采用了ＯＩＥ规定的病原分离与鉴定、血凝和血凝抑制试验方法；———本标准增加了ＯＩＥ中提及但没有详细操作规程的反转录聚合酶链反应、荧光反转录聚合酶链反应的具体试验步骤；———本标准删除了ＯＩＥ中提及但没有详细操作步骤的酶联免疫吸附试验。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局。本标准主要起草人：徐海聂、胡永强、罗宝正、谷强、张常印、薄清如、廖秀云、王云华、沙才华、管恩平、邱阳、朱广勤、王海艳。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ／Ｔ０７６４—１９９９；———ＳＮ／Ｔ１１０９—２００２；———ＳＮ／Ｔ１１１０—２００２；———ＳＮ／Ｔ１６８６—２００５。Ⅰ犛犖／犜０７６４—２０１１新城疫检疫技术规范１ 范围本标准规定了禽类新城疫的临床诊断、病毒分离与鉴定、血凝和血凝抑制试验、反转录聚合酶链反应、荧光反转录聚合酶链反应的操作规程。本标准适用于进出口禽类及其产品中新城疫的检疫。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 临床诊断３．１ 发病症状新城疫简介参见附录Ａ。当禽出现以下部分或全部情形时，可作为初步诊断的依据之一：ａ） 发病急，死亡率高；ｂ） 体温升高，极度精神沉郁，呼吸困难，食欲下降；ｃ） 粪便稀薄，呈黄绿色或黄白色；ｄ） 出现扭颈、翅膀麻痹等神经症状；ｅ） 免疫禽群出现产蛋下降。３．２ 病理变化当禽出现以下肉眼可见的病变时，可作为初步诊断定性的依据之一：ａ） 全身粘膜和浆膜出血，以呼吸道和消化道最为严重；ｂ） 腺胃粘膜水肿，乳头和乳头间有出血点；ｃ） 盲肠扁桃体肿大、出血、坏死；ｄ） 十二指肠和直肠粘膜出血，有的可见纤维素性坏死病变；ｅ） 脑膜充血和出血，鼻道、喉、气管粘膜充血、偶有出血，肺可见淤血和水肿。当禽出现上述病变时，应进行实验室确诊。４ 实验室诊断４．１ 病毒分离与鉴定４．１．１ 设备、材料和试剂４．１．１．１ 器材：生物安全柜、离心机、Ｖ型微量血凝板、微量可调移液器、恒温箱等。１犛犖／犜０７６４—２０１１４．１．１．２ 抗生素：青霉素、链霉素、卡那霉素和制霉菌素等。４．１．１．３ ９日龄～１１日龄ＳＰＦ鸡胚、１日龄ＳＰＦ雏鸡。４．１．１．４ ｐＨ７．０～７．４，０．０１ｍｏｌ／Ｌ等渗磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）：配制方法见附录Ｂ。４．１．１．５ ０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠：配制方法见附录Ｂ。４．１．１．６ 阿氏液：红细胞保存液，配制方法见附录Ｂ。４．１．１．７ １％鸡红细胞（ＲＢＣｓ）：配制方法见附录Ｂ。４．１．１．８ 拭子：脱脂棉球直径约０．４ｃｍ，１．０３４×１０５Ｐａ高压蒸汽灭菌１５ｍｉｎ。４．１．１．９ 新城疫病毒标准阳性血清和标准阴性血清：由指定单位提供。４．１．２ 样品采集和制备４．１．２．１ 活禽采集咽喉拭子和泄殖腔拭子（需带有可见粪便），雏禽采集新鲜粪便。４．１．２．２ 死禽无菌采集肺、肾、肠（包括内容物）、脾、脑、肝、心组织和骨髓，采集咽喉拭子。这些样品可单独或者混合存放，但肠内容物需单独处理。４．１．２．３ 样品置于含抗生素的ｐＨ７．０～７．４等渗磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ），组织和咽喉拭子保存液中含青霉素（２０００Ｕ／ｍＬ）、链霉素（２ｍｇ／ｍＬ）、卡那霉素（５０μｇ／ｍＬ）和制菌霉素（１０００Ｕ／ｍＬ），而粪便、肠内容物和泄殖腔拭子保存液抗生素浓度应提高５倍。加入抗生素后用０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠调ｐＨ值到７．０～７．４。４．１．２．４ 粪便和搅碎的组织，用含抗生素的ＰＢＳ制成１０％～２０％（质量浓度）的悬浮液，拭子浸入２ｍＬ～３ｍＬ含抗生素的ＰＢＳ中，充分振荡。在４℃作用４ｈ或过夜，或室温（不超过２５℃）作用１ｈ～２ｈ，或３７℃作用３０ｍｉｎ。拭子在反复挤压后弃去。４．１．２．５ ４℃３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液经０．２２μｍ滤膜过滤除菌。４．１．２．６ 采集或处理的样品在２℃～８℃条件下保存应不超过４ｄ，若需长期保存，应放置－７０℃冰箱，但应避免反复冻融。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。４．１．３ 病毒分离培养４．１．３．１ 鸡胚接种吸取除菌液经尿囊腔接种至少５枚９日龄～１１日龄的ＳＰＦ鸡胚，０．２ｍＬ／枚，３５℃～３７℃孵育４ｄ～７ｄ。接种后每天检查鸡胚生长情况。４．１．３．２ 病毒收获收集死胚、濒死鸡胚和培养结束时存活的鸡胚，置冰箱４℃致冷４ｈ～２４ｈ，无菌采集尿囊液。４．１．４ 病毒鉴定４．１．４．１ 血凝试验（犎犃）用ＨＡ检测尿囊液的血凝活性。ＨＡ呈阴性反应的尿囊液用另一批９日龄～１１日龄的ＳＰＦ鸡胚至少再传代一次，若ＨＡ结果仍为阴性，则判定新城疫病毒分离阴性。试验方法同４．２．３。４．１．４．２ 血凝抑制试验（犎犐）ＨＡ呈阳性的尿囊液用新城疫病毒标准阳性血清进行ＨＩ试验，以确认是否有新城疫病毒的存在。试验方法同４．２．４。２犛犖／犜０７６４—２０１１４．１．５ 脑内接种致病指数（犐犆犘犐）测定４．１．５．１ ＨＡ滴度高于２４（大于１／１６）的新鲜感染尿囊液（不超过２４ｈ～４８ｈ，细菌检验为阴性），用等渗无菌盐水作１０倍稀释，不加添加剂如抗生素。４．１．５．２ 脑内接种出壳２４ｈ～４０ｈ的ＳＰＦ雏鸡，共接种１０只，每只接种０．０５ｍＬ。４．１．５．３ 每２４ｈ观察一次，共观察８ｄ。４．１．５．４ 每天观察应给鸡打分，正常鸡记作０，病鸡记作１，死鸡记作２（每只死鸡在其死后的每日观察中仍记作２）。４．１．５．５ 犐犆犘犐是每只鸡８ｄ内所有每次观察数值的平均数，计算方法见式（１）：犐犆犘犐＝∑狊×１＋∑犱×２犜…………………………（１） 式中：∑狊———８ｄ累计发病数；∑犱———８ｄ累计死亡数；犜———８ｄ累计观察鸡的总数。犐犆犘犐越大，新城疫病毒致病性越强，最强毒力病毒的犐犆犘犐将接近最大值２．０，而弱毒株的犐犆犘犐近于０。使用弱毒疫苗，分离株的犐犆犘犐值在０．７以上，可认为强毒力病毒感染。４．２ 血凝（犎犃）和血凝抑制试验（犎犐）４．２．１ 材料和试剂４．２．１．１ 器材：Ｖ型微量血凝板、微量可调移液器等。４．２．１．２ ｐＨ７．０～７．２，０．０１ｍｏｌ／Ｌ等渗磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）。４．２．１．３ １％鸡红细胞（ＲＢＣｓ）。４．２．１．４ 标准新城疫病毒抗原、阳性对照血清和阴性对照血清。４．２．１．５ ４ＨＡＵ抗原：配制方法见附录Ｂ。４．２．２ 样品采集和处理４．２．２．１ 新城疫病毒悬液：无菌收取鸡胚尿囊液。４．２．２．２ 鸡血清：无菌采取动物血液，凝固后分离血清，置于４℃或－２０℃保存备用。４．２．２．３ 除鸡外其他禽种的血清：需排除血清对鸡红细胞的非特异性凝集，处理方法为每０．５ｍＬ血清加２５μＬ鸡红细胞泥，轻轻振荡，静置至少３０ｍｉｎ，澄清，２０００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ～５ｍｉｎ，红细胞沉聚，吸出吸附过的血清供检。４．２．３ 血凝试验（犎犃）４．２．３．１ 在Ｖ型微量血凝板中每孔加２５μＬＰＢＳ。见表１。３犛犖／犜０７６４—２０１１表１ 血凝试验操作术式单位为微升４．２．３．２ 第１孔加入２５μＬ病毒悬液（如尿囊液），为精确计算血凝单位，病毒悬液开始可以作一系列密集稀释，如１／３，１／５，１／７等。４．２．３．３ 将病毒悬液或抗原在反应板上作２５μＬ的系列倍比稀释。第１２孔不加病毒悬液或抗原，设立为红细胞对照孔。４．２．３．４ 每孔再加２５μＬＰＢＳ。４．２．３．５ 每孔加入２５μＬ１％ＲＢＣｓ。４．２．３．６ 轻叩微量血凝板混合反应物，室温（约２０℃）静置４０ｍｉｎ，或４℃静置６０ｍｉｎ（若周围环境温度太高），在对照孔的ＲＢＣｓ显著呈钮扣状时判定结果。４．２．３．７ ＨＡ判定时，应将反应板倾斜，观察ＲＢＣｓ有无呈泪珠样流淌，完全凝集（无泪珠样流淌）的病毒最大稀释倍数为该抗原的血凝滴度，表示１个血凝单位（ＨＡＵ），再根据开始的稀释倍数精确计算血凝滴度。４．２．４ 血凝抑制试验（犎犐）４．２．４．１ 在Ｖ型微量血凝板中每孔加入２５μＬＰＢＳ。见表２。表２ 血凝抑制试验操作术式单位为微升４．２．４．２ 第一孔加２５μＬ血清。４．２．４．３ 在血凝板上将血清作横向的２５μＬ的倍比稀释。４．２．４．４ 每孔加入２５μＬ４ＨＡＵ抗原，室温下（２０℃）静置不少于３０ｍｉｎ，４℃不少于６０ｍｉｎ。４．２．４．５ 每孔加入２５μＬ１％（体积分数）的ＲＢＣｓ，轻晃混匀后，室温（约２０℃）静置约４０ｍｉｎ，如环境温度太高时，４℃放置约６０ｍｉｎ，当对照孔ＲＢＣｓ呈显著钮扣状时判定结果。４犛犖／犜０７６４—２０１１４．２．４．６ 每次测定应设已知滴度的阳性血清、阴性血清和红细胞对照。４．２．４．７ 结果判定如下：ａ） 红细胞均匀分散在孔底周围、倾斜血凝板时不流淌判为完全凝集，记作＋＋＋＋；７５％凝集记作＋＋＋；５０％凝集记作＋＋；２５％凝集记作＋；红细胞集中在孔底中央呈圆点、倾斜血凝板时与对照孔（仅含２５μＬＲＢＣｓ和５０μＬＰＢＳ）ＲＢＣｓ流淌相同的孔判定为不凝集或血凝抑制，记作－；ｂ） 完全抑制４ＨＡＵ抗原的最高血清稀释倍数为ＨＩ滴度；ｃ） 检查各种对照。阴性对照血清ＨＩ滴度不高于１∶４（２２或２ｌｏｇ２），阳性对照血清ＨＩ滴度应在已知滴度的一个稀释度以内，红细胞对照无自凝现象，结果有效，试验成立；ｄ） 如果１∶１６（２４或４ｌｏｇ２）稀释的血清或者高于这个稀释度的血清能抑制４ＨＡＵ的抗原，这种ＨＩ滴度被判为阳性。４．２．４．８ 在所有的确诊试验当中针对试验采用的ＨＡＵ应设抗原滴度的追溯性测定。４．３ 反转录聚合酶链反应（犚犜犘犆犚）４．３．１ 主要仪器设备４．３．１．１ ＰＣＲ仪。４．３．１．２ 凝胶电泳仪。４．３．１．３ 电泳仪。４．３．１．４ 紫外凝胶成像管理系统。４．３．１．５ 高速冷冻离心机。４．３．１．６ 微量可调移液器。４．３．１．７ 生物安全柜。４．３．２ 试剂４．３．２．１ ＤＥＰＣ水：配制方法见附录Ｂ。４．３．２．２ 裂解液Ｔｒｉ