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书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜０６６９—２０１１代替ＳＮ０６６９—１９９７出口肉及肉制品中庆大霉素残留检测方法杯碟法犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犵犲狀狋犪犿狔犮犻狀狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犿犲犪狋狊犪狀犱犿犲犪狋狆狉狅犱狌犮狋狊犳狅狉犲狓狆狅狉狋—犆狔犾犻狀犱犲狉狆犾犪狋犲犿犲狋犺狅犱２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前 言 本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准代替ＳＮ０６６９—１９９７《出口肉及肉制品中庆大霉素残留量检验方法 杯碟法》。本标准与ＳＮ０６６９—１９９７相比，主要技术变化如下：———将原标准由定量检测方法变更为定性检测方法；———将原标准名称《出口肉及肉制品中庆大霉素残留量检验方法 杯碟法》修订为《出口肉及肉制品中庆大霉素残留检测方法 杯碟法》；———重新核实了原标准的检测低限，由０．１ｍｇ／ｋｇ修订为０．０５ｍｇ／ｋｇ。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国海洋大学。本标准主要起草人：刘云国、林洪、刘帅帅、贾俊涛、雷质文、林黎明、李正义、马维兴、唐静、张健、房保海、祝素珍、赵丽青、姜英辉、马云、韩青、李明哲、颜显辉。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：———ＳＮ０６６９—１９９７。Ⅰ犛犖／犜０６６９—２０１１出口肉及肉制品中庆大霉素残留检测方法杯碟法１ 范围本标准规定了出口肉及肉制品中庆大霉素残留检测的杯碟方法。本标准适用于出口鸡肉中庆大霉素残留的筛选检测，阳性结果应用其他方法进行确认。２ 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。ＧＢ／Ｔ６６８２ 分析实验室用水规格和试验方法３ 试样制备与保存３．１ 试样制备将代表性样品中的可食部分放入绞碎机中绞碎。充分混匀，用四分法缩分至不少于５００ｇ，作为试样。装入清洁容器内，加封后，标明标记。在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。３．２ 试样保存将试样于－１８℃以下冷冻保存。４ 原理用磷酸盐缓冲液（ｐＨ８．０±０．１）提取试样中的庆大霉素残留物，离心后取上清液作为样液，以表皮葡萄球菌（犛狋犪狆犺狔犾狅犮狅犮犮狌狊犲狆犻犱犲狉犿犻犱犻狊）作为指示菌，用杯碟法进行检测。５ 仪器和设备５．１ 培养皿：内径９０ｍｍ、底部平整光滑的玻璃皿或塑料皿，配陶瓦盖，或玻璃盖内嵌入干燥的滤纸。５．２ 牛津杯：不锈钢圆筒，外径８．０ｍｍ±０．１ｍｍ，内径６．０ｍｍ±０．１ｍｍ，高１０．０ｍｍ±０．１ｍｍ。５．３ 克氏瓶：８００ｍＬ。５．４ 游标卡尺：测量范围０ｍｍ～２００ｍｍ，精度０．０２ｍｍ。５．５ 均质器：转速不低于８０００ｒ／ｍｉｎ。５．６ 离心机：转速不低于４０００ｒ／ｍｉｎ。５．７ 恒温水浴锅：０℃～１００℃，精度±１℃。５．８ 恒温培养箱：３６℃±１℃，搁板应保持水平。１犛犖／犜０６６９—２０１１５．９ 高压灭菌锅。５．１０ 半对数坐标纸。５．１１ 旋转蒸发器。５．１２ 可调移动器：１０μＬ～１００μＬ，１００μＬ～１０００μＬ。６ 试剂和材料除另有规定外，所用试剂均为分析纯，试验用水为蒸馏水、去离子水，试验用水应符合ＧＢ／Ｔ６６８２的规定。６．１ 试验菌种表皮葡萄球菌（犛狋犪狆犺狔犾狅犮狅犮犮狌狊犲狆犻犱犲狉犿犻犱犻狊），菌号ＣＭＣＣ１２２２８。６．２ 培养基６．２．１ 增菌用液体培养及见Ａ．１。６．２．２ 保存及传代用液体培养及见Ａ．２。６．２．３ 检定用液体培养及见Ａ．３。６．３ 硫酸庆大霉素标准品已知纯度标准品，密封避光，防潮，４℃保存。６．４ 磷酸盐缓冲液（狆犎８．０±０．１）称取１３．３ｇ磷酸二氢钾及６．２ｇ氢氧化钾，溶解于１０００ｍＬ水中，于１２１℃灭菌１５ｍｉｎ。６．５ 庆大霉素标准储备液准确称取适量的硫酸庆大霉素标准品，用磷酸盐缓冲液配制成浓度为１０００μｇ／ｍＬ的标准储备液。保存于４℃冰箱中，可使用１个月。６．６ 庆大霉素标准工作液取一定量庆大霉素标准储备液，用磷酸盐缓冲液稀释成浓度为０．０５μｇ／ｍＬ的庆大霉素标准工作液，应当日配制。６．７ 生理盐水称取８．５ｇ氯化钠，溶解于１０００ｍＬ水中，分装后，于１２１℃灭菌１５ｍｉｎ。７ 检测方法７．１ 样液制备称取１０ｇ试样，置于均质杯中，加入１０ｍＬ磷酸盐缓冲液，８０００ｒ／ｍｉｎ均质３ｍｉｎ后，室温放置６０ｍｉｎ，移入离心管中４０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清液于作为待测样液。７．２ 菌悬液制备将试验菌种接种于装有培养基Ⅰ的试管中，于３６℃±１℃培养２４ｈ±１ｈ。移１ｍＬ菌液于盛有适２犛犖／犜０６６９—２０１１量培养基Ⅱ的克氏瓶中，使菌液均匀覆盖在琼脂表面，于３６℃±１℃培养２４ｈ±１ｈ。然后用适量生理盐水将菌苔洗下，备用。置４℃冰箱中（不宜超过１周）。７．３ 检定平板的制备在测定前，需进行预测试，以求得菌悬液最佳用量。用０．０５μｇ／ｍＬ庆大霉素标准工作液对加有不同量的菌悬液的平板进行测试，经培养后能使得０．０５μｇ／ｍＬ标准工作液在平板上产生直径在１０ｍｍ以上的清晰、完整的抑菌圈的菌悬液用量为最佳用量。将培养基Ⅲ融化，冷却至５０℃左右，加入最佳用量的菌悬液，使其充分混匀后，取１０ｍＬ，注入灭菌培养皿中，保持水平，凝固后即为检定平板。制备好的平板置２℃～８℃冰箱可保存２ｄ～３ｄ。７．４ 样液的测定取制备好的检定用平板两个，在平板底部作好标记，把牛津杯适当间隔置于平板上，每个平板最多不超过６个，在其中一个牛津杯中加入２８０μＬ０．０５μｇ／ｍＬ庆大霉素标准工作液作为阳性对照，其余牛津杯中加入２８０μＬ样液，冷藏放置３０ｍｉｎ后，３６℃±１℃培养８ｈ后开始观察，如果０．０５μｇ／ｍＬ庆大霉素标准工作液产生清晰、完整的抑菌圈时终止培养，如果无明显抑菌圈，继续观察至２４ｈ。用游标卡尺测量标准工作液和样液的抑菌圈直径大小。每份样品做两个平板上的平行试验。８ 结果判断和报告如样液在平板上无抑菌圈，０．０５μｇ／ｍＬ庆大霉素标准工作液的抑菌圈直径大于１０ｍｍ，即报告“阴性”。如样液在平板上呈现抑菌圈，抑菌圈直径在１０ｍｍ以上，即报告“初筛阳性”。如样液在平板上呈现抑菌圈，抑菌圈直径小于１０ｍｍ，大于８ｃｍ，或者两个平行结果不一致时，视为可疑，应重新测试后判定。阳性样品需要用确证方法进行定性及定量分析。９ 检测限本方法的检测限为０．０５ｍｇ／ｋｇ。３犛犖／犜０６６９—２０１１附 录 犃（规范性附录）培 养 基犃．１ 培养基Ⅰ胰蛋白胨 １０．０ｇ牛肉浸膏 ５．０ｇ氯化钠 ２．５ｇ水 １０００ｍＬ将上述成分于水中加热溶解，调节ｐＨ为６．５～６．６，分装于试管或克氏瓶中，于１２１℃灭菌１５ｍｉｎ。犃．２ 培养基Ⅱ胰蛋白胨 １０．０ｇ牛肉浸膏 ５．０ｇ氯化钠 ２．５ｇ琼脂 １４．０ｇ～１６．０ｇ水 １０００ｍＬ将上述成分于水中加热溶解，调节ｐＨ为６．５～６．６，分装于试管或克氏瓶中，于１２１℃灭菌１５ｍｉｎ，灭菌后可制成斜面。犃．３ 培养基Ⅲ蛋白胨 ６．０ｇ酵母浸膏 ４．０ｇ牛肉浸膏 １．５ｇ葡萄糖 １．０ｇ琼脂 １５ｇ水 １０００ｍＬ将各成分加热并溶解于水中，调节ｐＨ为６．５，于１２１℃灭菌１５ｍｉｎ，临用前用１ｍｏｌ／Ｌ氢氧化钠溶液，调节ｐＨ至８．０。４犛犖／犜０６６９—２０１１犉狅狉犲狑狅狉犱犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊犱狉犪犳狋犲犱犻狀犪犮犮狅狉犱犪狀犮犲狑犻狋犺狋犺犲犌犅／犜１．１—２００９．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊犪狀犪犿犲狀犱犿犲狀狋狋狅狋犺犲犛犖０６６９—１９９７《犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犵犲狀狋犪犿狔犮犻狀狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犿犲犪狋犪狀犱犿犲犪狋狆狉狅犱狌犮犲狊犳狅狉犲狓狆狅狉狋犆狔犾犻狀犱犲狉狆犾犪狋犲犿犲狋犺狅犱》．犌犲狀犲狉犪犾狋犲犮犺狀犻狇狌犲狉狌犾犲狊犪狀犱狋犲狊狋犻狀犵犿犲狋犺狅犱狊犻狀犛犖０６６９—１９９７狑犲狉犲狀狅狋犪犿犲狀犱犲犱犲狓狆犲犮狋狋犲狓狋犳狅狉犿犪狋犪狀犱狊狅犿犲犾犪狀犵狌犪犵犲犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀．犜犺犲犿犪犻狀犮犺犪狀犵犲狊犫犲狋狑犲犲狀狋犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犪狀犱犛犖０６６９—１９９７犪狉犲犪狊犳狅犾犾狅狑狊：—犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊狉犲狏犻狊犲犱狋狅犪狇狌犪犾犻狋犪狋犻狏犲狋犲狊狋犻狀犵犿犲狋犺狅犱犳狉狅犿犪狇狌犪狀狋犻狋犪狋犻狏犲狅狀犲．—犜犺犲狀犪犿犲狅犳狅狉犻犵犻狀犪犾狊狋犪狀犱犪狉犱“犕犲狋犺狅犱犳狅狉狋犺犲犱犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犵犲狀狋犪犿狔犮犻狀狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犿犲犪狋犪狀犱犿犲犪狋狆狉狅犱狌犮犲狊犳狅狉犲狓狆狅狉狋犆狔犾犻狀犱犲狉狆犾犪狋犲犿犲狋犺狅犱”狑犪狊狉犲狏犻狊犲犱狋狅“犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犵犲狀狋犪犿狔犮犻狀狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犿犲犪狋犪狀犱犿犲犪狋狆狉狅犱狌犮犲狊犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犆狔犾犻狀犱犲狉狆犾犪狋犲犿犲狋犺狅犱”．—犜犲狊狋犻狀犵狋犺狉犲狊犺狅犾犱狅犳狋犺犲狆狉犻犿犪狉狔狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊狉犲狏犲狉犻犳犻犲犱，０．１犿犵／犽犵狑犪狊狉犲狏犻狊犲犱狋狅０．０５犿犵／犽犵．犛犻狀犮犲狋犺犲犻犿狆犾犲犿犲狀狋犪狋犻狅狀狅犳狋犺犲狊狋犪狀犱犪狉犱犱犪狋犲，犛犖０６６９—１９９７狑犪狊犪犫狅犾犻狊犺犲犱犪狋狋犺犲狊犪犿犲狋犻犿犲．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊狆狉狅狆狅狊犲犱犫狔犪狀犱犻狊狌狀犱犲狉狋犺犲犮犺犪狉犵犲狅犳犆犺犻狀犪犖犪狋犻狅狀犪犾犚犲犵狌犾犪狋狅狉狔犆狅犿犿犻狊狊犻狅狀犳狅狉犆犲狉狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀犪狀犱犃犮犮狉犲犱犻狋犪狋犻狅狀．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊犱狉犪犳狋犲犱犫狔狋犺犲犛犺犪狀犱狅狀犵犈狀狋狉狔犈狓犻狋犐狀狊狆犲犮狋犻狅狀犪狀犱犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲犅狌狉犲犪狌狅犳狋犺犲犘犲狅狆犾犲’狊犚犲狆狌犫犾犻犮狅犳犆犺犻狀犪犪狀犱犗犮犲犪狀犝狀犻狏犲狉狊犻狋狔狅犳犆犺犻狀犪．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狑犪狊犿犪犻狀犾狔犱狉犪犳狋犲犱犫狔犔犻狌犢狌狀犵狌狅，犔犻狀犎狅狀犵，犔犻狌犛犺犪犻狊犺狌犪犻，犑犻犪犑狌狀狋犪狅，犔犲犻犣犺犻狑犲狀，犔犻狀犔犻犿犻狀犵，犔犻犣犺犲狀犵狔犻，犕犪犠犲犻狓犻狀犵，犜犪狀犵犑犻狀犵，犣犺犪狀犵犑犻犪狀，犉犪狀犵犅犪狅犺犪犻，犣犺狌犛狌狕犺犲狀，犣犺犪狅犔犻狇犻狀犵，犑犻犪狀犵犢犻狀犵犺狌犻，犕犪犢狌狀，犎犪狀犙犻狀犵，犔犻犕犻狀犵狕犺犲，犢犪狀犡犻犪狀犺狌犻．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狉犲狆犾犪犮犲犱狋犺犲狆狉犲狏犻狅狌狊狏犲狉狊犻狅狀狅犳狋犺犲狉犲犾犲犪狊犲狅犳狋犺犲狊狋犪狀犱犪狉犱犪狊犳狅犾犾狅狑狊：—犛犖０６６９—１９９７．５犛犖／犜０６６９—２０１１犇犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犵犲狀狋犪犿狔犮犻狀狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犿犲犪狋狊犪狀犱犿犲犪狋狆狉狅犱狌犮狋狊犳狅狉犲狓狆狅狉狋—犆狔犾犻狀犱犲狉狆犾犪狋犲犿犲狋犺狅犱１ 犛犮狅狆犲犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱狊狆犲犮犻犳犻犲狊狋犺犲犵犲狀狋犪犿狔犮犻狀狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犿犲犪狋犪狀犱犿犲犪狋狆狉狅犱狌犮狋狊犳狅狉犲狓狆狅狉狋犫狔犮狔犾犻狀犱犲狉狆犾犪狋犲犿犲狋犺狅犱．犜犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犻狊犪狆狆犾犻犮犪犫犾犲狋狅狋犺犲犱犲狋犲狉犿犻狀犪狋犻狅狀狅犳犵犲狀狋犪犿狔犮犻狀狉犲狊犻犱狌犲狊犻狀犮犺犻犮犽犲狀犳狅狉犲狓狆狅狉狋．犃狀狔狆狅狊犻狋犻狏犲狉犲狊狌犾狋狊犺狅狌犾犱犫犲犮狅狀犳犻狉犿犲犱犫狔狅狋犺犲狉犿犲狋犺狅犱．２ 犖狅狉犿犪狋犻狏犲犚犲犳犲狉犲狀犮犲犜犺犲犳狅犾犾狅狑犻狀犵狀狅狉犿犪狋犻狏犲犱狅犮狌犿犲狀狋狊犮狅狀狋犪犻狀狆狉狅狏犻狊犻狅狀狑犺犻犮犺，狋犺狉狅狌犵犺狉犲犳犲狉犲狀犮犲犻狀狋犺犻狊狋犲狓狋，犮狅狀狊狋犻狋狌狋犲狆狉狅狏犻狊犻狅狀狊狅犳狋犺犻狊狊狋犪狀犱犪狉犱犳狅狉犱犪