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项目名称：脑血管疾病发生和防治的基础研究首席科学家：苏定冯中国人民解放军第二军医大学起止年限：2009.1至2013.8依托部门：总后勤部卫生部上海市科委1一、研究内容以脑卒中为代表的脑血管疾病发生率高、危害性大。脑卒中的发生具有不可预测性，发生以后有效治疗的时间窗很小(3-6小时)，神经细胞一旦死亡病人的功能恢复非常困难。尽管急性期脑卒中的死亡率显著下降，但脑卒中的发生率是有增无减、越来越高。因此，预防脑卒中的发生是关系国计民生的重大科学问题。本项目要解决的关键科学问题是：(1)以脑卒中的发生机制为重点研究内容，确立干预脑卒中发生的新靶标。首先要深刻认识脑卒中发生的病理生理学机制和影响其发生的相关因素，找出其中可以作为药物干预的新的靶点，用经典的药物、基因治疗、转基因、基因敲除、RNA干扰等手段，对这些新的靶点进行验证性治疗，最终确定3-5个可用于脑卒中预防的新靶标；(2)以严格的脑卒中分型诊断和颅内动脉影像学诊断为基础，研究易感基因。通过严格的脑卒中分型诊断，建立脑卒中病人的分型数据库；通过严格的脑血管影像学检查，建立脑血管狭窄病人数据库。对他们的DNA进行SNP分析和其他研究，发现中国人各型脑卒中和高血压伴颅内动脉狭窄的易感基因，找出高效率的预测脑卒中发生的新指标。根据这些指标，探讨对高危人群进行干预的可能性；(3)以神经血管单元为对象，研究如何改善脑卒中的治疗。在脑卒中神经损伤与保护的研究方面，我们不应把恢复脑血流和保护神经元作为两个独立的治疗目标，而是要把神经血管单元作为一个整体进行研究。发现新的调节因素，作为干预靶点，改善脑卒中的治疗；(4)探索新技术、新方法和新的活性化合物在脑卒中研究和防治中的应用。随着分子生物学技术的发展，一大批新的技术和方法用于或将要用于临床。但在脑卒中的防治中尚不成熟。此外，脑卒中发生发展的深入的分子机制和信号转导通路尚不清楚。在本项目研究中，我们将首先完善两个技术平台：转基因技术平台和化学生物学平台(小分子探针技术平台)。利用这两个技术平台阐明脑卒中发生发展的深入的分子机制和信号转导通路，验证我们发现的脑卒中预防和治疗的新靶点。并希望给以后的临床应用提供理论基础。(一)脑卒中发生新的决定或影响因素研究鉴于已知的有关因素不足于解释脑卒中的发生，因此研究新的决定或影响因素是当今重要的研究前沿。以血管为基准，我们把这些影响因素分为血管内、2血管壁和血管外三个方面来叙述。从血管外(或全身性)因素看，关键的科学问题有：(1)动脉压力感受性反射(ABR)功能。我们以前的工作提示ABR功能低下导致脑卒中易发。那么，ABR功能低下是如何导致脑卒中易发的？尼古丁alpha7受体是否起重要作用？没有高血压存在的情况下，ABR功能低下是否也能导致脑卒中易发？(2)热量限制。我们在以往的研究中发现热量限制可以大幅度地延缓脑卒中的发生。那么，热量限制延缓脑卒中发生的主要机制是什么？Sirtuin是否起决定性作用？有无可能找到热量限制起保护作用的靶分子？由于热量限制在实践中不容易推广，有无可能用相应的靶分子作为药物新靶点，用药物替代限食？(3)炎症反应。全身性的炎症反应与脑卒中的发生有没有确切的关系？抗炎治疗能否作为脑卒中预防的新策略？在脑卒中的发生中最重要的炎症因子是哪一个？(4)脂肪细胞因子。具有调节代谢、胰岛素敏感性、血管功能、炎症免疫等多种功能活性的脂肪细胞因子能否作为脑卒中防治新靶标？能否寻找到有效调节脂肪细胞因子表达/活性的天然活性化合物？其脑卒中的防治疗效和机制如何？从血管因素看，血管重构是脑血管疾病发生的关键。以往对离子通道在脑血管重构中所起作用研究较少。少量的研究也仅仅涉及阳离子通道，对于氯离子通道在其中的作用主要由本项目组成员开展研究，刚刚起步。关键的科学问题有：平滑肌Cl-通道（容积调节性/ClC-3及Ca2+激活Cl-通道）与Ca2+通道（ROC和SOC）是怎样参与脑血管重构的？这些通道在脑卒中发生过程中起什么样的作用？其作用相关的分子机制是什么？如何为防治脑血管重构、进而预防脑卒中从离子通道角度提出新思路及新靶点？从血管内因素看，关键的科学问题有：巨噬细胞吞噬脂质成为泡沫细胞，与T淋巴细胞相互作用，分泌大量炎性因子，产生活动性炎症是不稳定斑块的重要特征。Tim分子对巨噬细胞及T淋巴细胞均有重要调控作用，Tim在巨噬细胞泡沫化、与T淋巴细胞相互作用并介导内皮细胞损伤中发挥什么作用？哪些分子在此过程中起到关键作用？能否针对这些分子进行干预以减轻或消除斑块内炎症？已知多种炎症因子可通过增强斑块纤维帽胶原的分解代谢途径而诱导斑块破裂，但这些因子在胶原代谢中的分子调节机制尚不清楚。能否通过研究炎症因子对各个胶原酶转录的影响以明确炎症在斑块易损中的作用机制和发现新的干预靶点？为解决这些科学问题，拟进行以下三方面的研究：31.影响脑卒中发生的全身性因素。(1)建立动物模型：对于脑卒中的动物实验大部分采用大脑中动脉阻塞，观察脑损伤情况。如果要对预防脑卒中的作用进行评价，必须使用自发性脑卒中动物模型。大鼠有遗传性的SHR-SP，但无法用于小鼠，这是个世界性难题。因此，建立小鼠自发性脑卒中动物模型十分必要，以便能使用基因敲除小鼠来研究自发性脑卒中的发生；(2)针对ABR功能。用alpah7基因敲除小鼠研究ABR功能低下导致脑卒中易发的alpha7机制；用我们自己培育的全世界唯一的自发性ABR功能缺陷大鼠进一步研究ABR功能与脑卒中的关系；寻找改善ABR功能的药物，用于脑卒中的预防；(3)针对热量限制。用Sirt1基因敲除小鼠和慢病毒RNA干扰，研究限食延缓脑卒中的Sirtuin机制；从天然药材中筛选Sirt1激动剂并用于脑卒中的预防；热量限制发挥脑卒中保护作用的其他机制研究，包括雌激素受体机制、ABR功能改善机制等；(4)针对炎症因子。用SHR-SP与普通的SHR比较，观察各组织和血清中炎症因子(或与炎症反应有关的因子)的差异表达。对差异表达明显的因子的相应基因进行测序，观察DNA有无突变位点，进一步研究该突变位点对蛋白表达有无影响(意义)。用基因敲除小鼠，制成2肾2夹自发性脑卒中模型，观察白介6、白介10、E－选择素等在脑卒中发生中的作用。用过表达的方法观察以上因子对SHR-SP脑卒中发生的影响；(5)针对脂肪细胞因子。采用多种干预手段，如：visfatin重组蛋白、特异性酶抑制剂FK866、酶产物NMN、抗体、基因overexpression、基因knockdown等，确认visfatin能否作为脑卒中防治新靶标；寻找能上调visfatin表达的天然活性化合物，研究其脑卒中防治疗效和机制；采用基因芯片差异筛选等策略，发现新的脂肪细胞因子，研究其对血管、脑细胞的作用，确认其能否成为脑卒中防治新靶标。(6)针对其他因素。通过蛋白质组学、基因芯片、代谢组学和miRNA芯片等手段，用SHR-SP和普通的SHR进行比较(以利于去除高血压引起的差别)，找出差异，进行深入的研究。比如我们发现SHR-SP大脑中的醛脱氢酶显著低于SHR，该酶的产物之一dopac降低。我们将研究：首先醛脱氢酶是怎样降低的，对相应的基因DNA测序，发现有无突变位点，如有特别，确定该突变是否足以引起表达差异。或者调节醛脱氢酶的基因发生了改变，等等。其次，研究醛脱氢酶降低的后果(底物dopal是一种醛，有细胞毒性)，是否与脑卒中的发生有关。2.影响脑卒中发生的血管壁因素。用SHRSP及2肾2夹肾血管性高血压大4鼠研究氯离子通道和钙离子通道在脑血管重构中的作用：(1)Ca2+激活Cl-通道。探讨在高血压脑血管重构过程中及脑卒中发生的脑血管平滑肌细胞Ca2+激活Cl-通道活性与调节的变化，以及与Ca2+调控之间的关系；(2)容积调节/ClC-3Cl-通道。研究高血压脑血管重构/脑卒中脑血管平滑肌细胞该通道的功能及调节通路变异；建立靶向敲除血管平滑肌ClC-3动物模型，在此基础上建立相应野生型动物高血压模型，在基因水平比较ClC-3对脑血管重构的影响；研究ClC-3对脑血管平滑肌细胞增殖/凋亡调节机理；确定ClC-3功能型酪氨酸磷酸化位点；研究ClC-3-ROS在脑卒中发生所扮演的角色；(3)Ca2+通道。研究在脑血管重构及脑卒中发生过程脑血管平滑肌细胞ROC/SOC功能变化；研究ROC/SOC对脑血管平滑肌细胞增殖/凋亡及ROS生成作用与机理；观察特异性阻断ROC/SOC的人参皂甙单体Rd干预后对脑血管重构脑卒中的作用及相关作用机理。3.影响脑卒中发生的血管内因素。(1)不稳定斑块活动性炎症机制的研究。巨噬细胞泡沫化及其与T细胞的相互作用在不稳定斑块活动性炎症形成中具有重要作用。拟研究Tim分子在不稳定斑块形成中各类免疫细胞上的表达及其表达调控模式；Tim在AS特异性抗原ox-LDL活化巨噬细胞中的作用及其分子机制；Tim对巨噬细胞-T淋巴细胞相互作用的影响；Tim通路在斑块破裂过程中主要炎症细胞功能发挥中的作用，寻找关键分子，应用siRNA等手段干扰关键分子或其胞内信号传导通路以观察对不稳定斑块破裂的影响；(2)炎症介导血管胶原代谢的分子机制研究。我们首次阐明了TNF导致斑块纤维帽胶原降解和斑块易损的ASK1–JNK–NonO的信号转导通路。拟继续做如下研究：观察血管炎症中主要的炎性因子对脑血管壁中富含的I型、III型和VI型胶原代谢的影响；应用siRNA及PGL-3荧光报告载体等技术,发现启动子反应序列及相应的转录因子，并应用通路抑制剂和过表达载体等观察炎症因子干预胶原代谢的信号转导通路；研究TNF对P4H1干预调节的机制，观察NonO和DJ-1蛋白的变化。观察ROS通路在TNF导致的DJ-1过氧化形成OX-DJ-1的过程中所起的作用；(3)其他研究。包括高血压导致血管壁细胞凋亡机制的研究，非瓣膜病心房颤动时血栓形成机制的研究，脑卒中早期生物标志物的研究和血管内皮细胞eNOS表达分子机制的研究等。5(二)脑卒中的易感基因研究脑卒中有许多亚型，各种亚型的发生机制不一样，其相应的易感基因也可能不一样。以往对脑卒中易感基因的研究成效不大的原因可能与此有关。能否通过建立中国人的脑卒中分型资料库，发现不同发病机制分型的脑卒中患者的易感基因，提高脑卒中预测、预防的有效性，是一个重要的问题。此外，颅内动脉狭窄是国人缺血性脑卒中的理想中间表型。能否通过研究与颅内动脉狭窄相关易感基因，识别国人缺血性脑卒中易感基因，进而找出可用作预测、预防脑卒中的基因变异？为解决这些问题，本项目拟进行以下研究工作：1.研究各亚型脑卒中的易感基因。通过进行包括脑卒中临床、实验室检查、辅助检查、治疗及预后等信息的大样本登记研究，建立以发病机制为基础的脑卒中分型数据库，研究不同发病机制分型脑卒中患者的生化标记物和易感基因，对不同的发病机制分型与患者的临床表现与预后等进行相关性研究。2.研究颅内动脉狭窄病人的易感基因。通过对高血压患者中无症状性颅内动脉狭窄的筛查及其危险因素分析，为全基因组关联研究提供样本，并阐明高血压患者发生颅内动脉狭窄的危险因素；开展颅内动脉狭窄的全基因组关联研究，识别国人高血压患者中与颅内动脉狭窄相关的SNP位点；通过为期3年的随访研究，进一步验证上述研究发现的基因位点及心血管危险因素在颅内动脉狭窄发生、发展中的作用。3.脑卒中的家系研究。大部分脑卒中的遗传属于多基因遗传，但是也存在一些以脑卒中为主要表现的单基因遗传病。对脑卒中的特殊家系研究，有可能发现新的单基因遗传性疾病。如果是多基因遗传，家系研究也有助于发现易感基因。我们最近收集到2个大的脑卒中家系。(三)针对脑卒中神经损伤和神经保护的研究针对缺血性脑卒中神经损伤与神经保护的研究，长期以来主要聚焦于神经元而忽略了占脑体积90％以上的神经胶质细胞(包括星形胶质细胞、小胶质细胞等）。近年来的研究表明保护胶质细胞的正常生理功能已经成为脑卒中神经保护的重要策略。进而，应该重视神经血管单元(neurovascularunit)的集成研究。神经血管单元包括：神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、血管内皮