DB32∕T 3372-2018 东方百合脱毒技术规程

ICS65.020.20B05备案号：58108-2018DB32江苏省地方标准DB32/T3372—2018东方百合脱毒技术规程Technicalregulationofvirus-freefororientallily2018-2-10发布2018-3-10实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T3372—2018I目  次前言.....................................................................................................................................................................II1范围.................................................................................................................................................................12规范性引用文件.............................................................................................................................................13术语和定义.....................................................................................................................................................14脱毒设备（施）及化学试剂.........................................................................................................................15组培室消毒灭菌.............................................................................................................................................16种源获取.........................................................................................................................................................17病毒检测.........................................................................................................................................................3DB32/T3372—2018II前  言本标准按GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由连云港市农业科学院提出并归口。本标准起草单位：连云港市农业科学院。本标准主要起草人：赵统利、孙明伟、邵小斌、朱朋波、汤雪燕、王江英。DB32/T3372—20181东方百合脱毒技术规程1范围本标准规定了东方百合脱毒技术的术语和定义、脱毒设备、组培室消毒灭菌、种源获取、病毒检测等技术要求。本标准适用于具备生物技术条件下的东方百合脱毒技术。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T18247主要花卉产品等级第6部分：花卉种球NY/T1491花卉植物病毒检测规程NY/T2306花卉种苗组培快繁技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1东方百合orientallily由天香百合、鹿子百合、日本百合、红花百合等种与湖北百合的杂种中选育出来的栽培杂种系。4脱毒设备4.1组培场地建设组培实验室应选择安静、清洁、无污染的地方。4.2洗涤设备工厂化生产可选用自动洗瓶机，另外配置干燥箱、晾瓶架等。4.3百合脱除病毒设备超净工作台、培养箱、解剖刀、镊子、解剖针、解剖镜等。4.4灭菌设备高压蒸汽灭菌锅、器械消毒器、紫外灯、烘干箱、微滤孔器等。DB32/T3372—201825组培室消毒灭菌按NY/T2306要求进行组培室消毒。6种源获取6.1鳞片诱导成鳞茎6.1.1鳞片选取选取完整、无病虫害无病斑且周径≥14cm的百合鳞茎，由外向内完整的剥取中层鳞片，流水冲洗净表面泥垢后,用0.2%～0.5%的洗衣粉水冲洗10min，在自来水流水条件下冲洗30min。6.1.2外植体获取用75%酒精灭菌30s，再用0.1%的升汞溶液浸泡8min～10min，期间不断进行摇动，使鳞片充分与溶液混合，最后用无菌水冲洗5次～6次。将鳞片外围1mm的部分切除，然后选取外层下部与鳞茎盘相连的部分为最佳外植体横切约为0.5cm厚的小块。6.1.3诱导与增殖愈伤组织6.1.3.1愈伤培养基配方MS+2mg/L6-BA+1mg/L2，4-D+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，pH为5.8～6.0。6.1.3.2鳞片接种将切好的百合鳞片，将底部切口平放于诱导愈伤培养基上，形成愈伤。6.1.4愈伤诱导成小鳞茎6.1.4.1培养基配方MS+0.5mg/L6-BA+15g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，pH为5.8～6.0。6.1.4.2愈伤接种将鳞片上的愈伤取出并切成黄豆粒大小，平放于诱导愈伤培养基上。6.1.4.3培养条件愈伤及成鳞茎诱导均放置于培养室中，置于23℃～27℃，进行光照与黑暗比例为16h/8h条件下培养，光照强度为3000lx～5000lx。在培养期间，每隔20d更换一次培养基。6.2组培鳞茎增大培养6.2.1组培鳞茎增大培养基配方MS+1mg/LIBA+60g/L蔗糖+6.5g/L，pH为5.8～6.06.2.2小鳞茎接种将分化的小鳞茎接种到组培鳞茎增大培养基上培养。DB32/T3372—201836.2.3培养条件将接种的鳞茎，置于23℃～27℃条件下，暗培养60d即可长成直径大于0.5cm以上的组培鳞茎。在培养期间，每隔20d更换一次培养基。6.3打破休眠把增大的组培鳞茎，整瓶转至4℃暗培养的冷藏室内，暗培养60d～80d解除休眠。6.4热处理将解除休眠的百合鳞茎，整瓶置于人工气候箱中每天升高1℃至变温培养（38℃-10h，26℃-14h）,暗培养持续15d～25d。6.5剥取茎尖培养成鳞茎6.5.1茎尖诱导愈伤培养基MS+2.5mg/LPicloram+30g/L蔗糖+6.5g/L琼脂，pH为5.8～6.06.5.2茎尖接种把热处理过的百合组培鳞茎，在10倍～80倍的解剖镜下，用解剖刀剥除外部鳞片漏出生长点，用解剖针挑取0.5mm～0.7mm大小的茎尖生长点接种到诱导愈伤培养基上。6.5.3培养条件将接种的茎尖至于25℃条件下，全暗培养60d～80d，每20d更换一次培养基。6.6愈伤诱导成球按6.1.4与6.2的步骤进行百合籽球的培养。7病毒检测将脱毒的百合组培鳞茎，采用多重RT-PCR法（引物序列见表1）进行主要病毒（黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）、百合无症病毒（Lilysymptomlessvirus，LSV）和百合斑驳病毒（Lilymosettlevirus，LMoV）的检测，检测结果为阴性，说明鳞茎不带病毒可作为百合无病毒种源继续扩繁，如果为阳性，说明脱毒不够彻底，不能作为无病毒种源。表1百合主要病毒检测的引物序列病毒Viruses上游引物Upprimer(5’-3’)下游引物Downprimer(5’-3’)CMVATGGACAAATCTGAATCAACCAGTCAGACTGGGAGCACTCCAGLMoVCACCTCACCAAATGTAAATGGTAGAAATTCCAAGTAAGGAGTGCLSVGAAGAAGCACGCTGGACTGCGCCTGATGATCCCCTC_________________________