DB21∕T 2138-2013 仿刺参基因识别检测方法

ICS67.120.30B50备案号：DB21辽宁省地方标准DB21/T××××—2013仿刺参基因识别检测方法IdentificationofApostichopusjaponicusgenedetectionmethod（报批稿）（本稿完成日期：2013.2.1）2013-**-**发布2013-**-**实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T××××—2013I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由大连市产品质量监督检验所、大连标准检测技术研究中心提出。本标准由大连市质量技术监督局归口。本标准由大连市产品质量监督检验所、大连标准检测技术研究中心负责起草。本标准主要起草人：杨滴、刘彦泓、刘岑杰、夏元凤、刘紫群、姜俊、于利军、董广彬、郝苗、闵健、李鹏。本标准于2013年**月**日首次发布。DB21/T××××—20131仿刺参基因识别检测方法1范围本标准规定了仿刺参基因识别检测方法的术语、定义、缩略语、原理、试剂、主要仪器、试样制备、操作步骤、结果判定。本标准适用于仿刺参基因识别检测。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求3术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1.1仿刺参（Apostichopusjaponicus）为棘皮动物门、游走亚门、海参纲、楯首目、刺参科、仿刺参属的动物，俗名刺参。分布于北太平洋区、包括俄罗斯、日本、朝鲜半岛沿岸以及中国大陆的辽宁、河北、山东、江苏等地，常见于波流静稳、海草繁茂和无淡水注入的港湾内以及底质为岩礁或硬底。3.2缩略语下列缩略语适用于本标准。3.2.1Real—timePCR：实时荧光PCR（Real-timepolymerasechainreaction）3.2.2DNA:脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）3.2.3Tris:三（羟甲基）氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane）3.2.4Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。3.2.5FAM:6-羧基荧光素，荧光基团（6-carboxyfluorescein）3.2.6TAMRA：6-羧基四甲基罗丹明，淬灭荧光基团（6-carboxytetramethylrhodamine）DB21/T××××—201323.2.718srRNA:真核生物18s核糖体RNA基因4原理根据仿刺参线粒体保守基因片段，设计引物及荧光探针。利用实时荧光PCR方法识别仿刺参特异性基因。实时荧光PCR方法是PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5＇端——3＇端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。5防污染措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行。6试剂和主要仪器6.1试剂除另有规定外，所有试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682规定的一级水。6.1.1三羟基甲基氨基甲烷（Tris）；6.1.2三氯甲烷；6.1.3无水乙醇；6.1.4异丙醇；6.1.5乙二胺四乙酸钠盐（Na2EDTA）；6.1.6盐酸（HCL）；6.1.7氢氧化钠(NaOH)；6.1.8苯酚+三氯甲烷+异戊醇（25+24+1，体积比）；6.1.9三氯甲烷+异戊醇（24+1，体积比）；6.1.10乙酸钠溶液：3mol/L乙酸钠溶液，乙酸调节pH为5.2；6.1.11Tris饱和酚；6.1.12TE缓冲液：Tris0.01mol/L,Na2EDTA0.001mol/L,用HCL或NaOH调节pH为8.0。6.2主要仪器6.2.1实时荧光PCR仪；6.2.2超净工作台；DB21/T××××—201336.2.3消毒灭菌锅；6.2.4核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计；6.2.5高速冷冻离心机；6.2.6低温冰箱；6.2.7纯水器；6.2.8微量进样器。7试样的制备采样工具（剪刀、镊子、研钵）应经过180℃，2h高温灭菌。称取约100g样品，将样品在研钵中研碎。8操作步骤8.1DNA提取8.1.1苯酚-三氯甲烷法取0.2g研碎好的样品放入2.0mL离心管，加入400μLTE缓冲液，于65℃水浴中溶解10min，上下颠倒混匀。加入与溶液等体积苯酚+三氯甲烷+异戊醇（25+24+1）溶液，摇晃混匀10min。12000r/min室温离心10min，将上清液转移至另一个2mL离心管中。加入上清液等体积氯仿+异戊醇（24+1）溶液，摇晃混匀10min。12000r/min室温离心10min，小心吸取上清液。加入上清液1/10体积乙酸钠溶液、等体积异丙醇，混匀后室温静置10min。12000r/min室温离心10min，弃去上清液。70%乙醇洗涤沉淀2～3次，干燥DNA。50μLTE缓冲液溶解沉淀，4℃保存。8.1.2试剂盒法使用不同的商品化基因组提取试剂盒，使用时按照操作说明书进行操作。8.2DNA浓度和纯度的测定取5μLDNA溶液，用TE缓冲液稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计检测260nm和280nm处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按式（1）计算：100050NAC...............................(1)式中：C——DNA浓度，μg/μL；A——260nm处的吸光值；N——核酸稀释倍数。当A260/A280比值为1.7～1.9之间时，适宜实时荧光PCR扩增。8.3实时荧光PCR反应8.3.1引物和探针DB21/T××××—20134实时荧光PCR用引物序列见表1。表1实时荧光PCR用引物序列检测基因引物序列适用范围18S5＇CCTGAGAAACGGCTACCAT3＇真核生物（内参照基因）5＇CGTGTCAGGATTGGGTAAT3＇线粒体5＇GACAATTTTCGCCCGACACT3＇仿刺参特异性基因5＇AAGTTGGTTGGGAAAATGTAAAGG3＇实时荧光PCR用探针序列见表2。表2实时荧光PCR用探针序列检测基因探针序列适用范围18S5＇(FAM)-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-(TAMRA)3＇真核生物（内参照基因）线粒体5＇(FAM)-ATTTATCCCCCTACAGTTAGTTTCCT-(TAMRA)3＇仿刺参特异性基因8.3.2实时荧光PCR反应体系实时荧光PCR反应体系见表3。表3实时荧光PCR反应体系试剂名称最终浓度10×PCR缓冲液(不含氯化镁)1×氯化镁溶液(25mmol/L)2.5mmol/LdNTP溶液(各2.5mmol/L)各0.2mmol/LUNG酶0.075U上游引物(20μmol/L)0.2μmol/L下游引物(20μmol/L)0.2μmol/LTaqMan探针(10μmol/L)0.1μmol/LTaq酶2.5UDNA模板(100ng/μL)300ng补水至50μL8.3.3实时荧光PCR反应条件实时荧光PCR反应参数：95℃预变性，30s；95℃变性5s、60℃延伸31s，共40个循环。注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。8.3.4对照阳性对照：仿刺参基因组DNA、真核生物基因组DNA阴性对照：已知以不含仿刺参基因的样品提取的DNADB21/T××××—20135空白对照：双蒸水（ddH2O）9结果判断与表述9.1结果分析条件设定直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整。9.2结果判定9.2.1对照结果空白对照：外源基因检测Ct值≥40，内参照基因检测Ct值≥40；阴性对照：外源基因检测Ct值≥40，内参照基因检测结果20≤Ct值≤30；阳性对照：外源基因检测Ct值≤36。9.2.2检测结果的判定待测样品外源基因检测Ct值≥40，内参照基因检测结果20≤Ct值≤30，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判断该样品未检出仿刺参特异性基因。待测样品外源基因检测Ct值≤36，内参照基因检测结果20≤Ct值≤30，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判断该样品检出仿刺参特异性基因。待测样品外源基因检测结果36＜Ct值＜40，内参照基因检测结果20≤Ct值≤30，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，应再次实验。如再次实验外源基因检测结果36＜Ct值＜40，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判断该样品未检出仿刺参特异性基因。9.3结果表述检出仿刺参特异性基因；未检出仿刺参特异性基因。_________________________________