DB14∕T 1515-2017 食用百合脱毒试管苗繁育技术规程

ICS65.020.20B05DB14山西省地方标准DB14/T1515—2017食用百合脱毒试管苗繁育技术规程2017-12-10发布2018-02-10实施山西省质量技术监督局发布DB14/T1515—2017I目次前言................................................................................II1范围..............................................................................12规范性引用文件....................................................................13术语和定义........................................................................14生产设施和仪器设备................................................................25培养基............................................................................26环境消毒和无菌操作................................................................27脱毒母株的获取....................................................................38脱毒试管苗鳞茎的诱导和增殖........................................................39脱毒试管鳞茎生根..................................................................410脱毒试管鳞茎的移栽...............................................................4DB14/T1515—2017II前言本标准按照BG/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山西农业大学提出并归口。本标准起草单位：山西农业大学。本标准主要起草人：赵娟、温银元、尹美强、张彬、王计平、宋喜娥、董淑琦、原向阳、王玉国、郭平毅。DB14/T1515—20171食用百合脱毒试管苗繁育技术规程1范围本标准规定了食用百合脱毒试管苗（鳞茎）繁育的生产设施和仪器设备、培养基、环境消毒和无菌操作、脱毒母株的获取、脱毒试管苗鳞茎的诱导和增殖、脱毒试管鳞茎生根及脱毒试管鳞茎的移栽。本标准适用于食用百合脱毒试管苗的繁育。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。NY/T1491花卉植物病毒检测规程NY/T1744切花百合脱毒种球3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1脱毒试管苗在无菌条件下，应用茎尖组织培养技术获得，不带LSV（百合无症病毒）、CMV（黄瓜花叶病毒）、LMoV（百合斑驳病毒）病毒的，在封闭容器内繁殖的种苗。3.2鳞片着生在鳞茎盘上的叶基或者叶鞘膨大而成的变态叶。3.3鳞茎在短缩茎盘省着生的肉质叶鞘膨大而成的变态器官。3.4脱毒试管鳞茎无菌条件下，在封闭培育容器内由脱毒试管苗诱导形成的鳞茎。3.5DB14/T1515—20172籽球通过组培苗或鳞片繁殖形成的周长小于3cm的小鳞茎。4生产设施和仪器设备4.1生产设施准备室、无菌室、培养室、检测室、温室等。4.2主要仪器设备超净工作台、压力蒸汽灭菌锅、鼓风干燥箱、光照培养箱、人工气候箱、冰箱体式显微镜（双筒解剖镜）、空调、照度计、自动控时器、温湿度计、酶标仪、高速冷冻离心机、电泳仪、电泳槽、PCR仪、微量移液器、电子天平、pH计、磁力搅拌器、电冰箱、移液枪、各种培养容器等。5培养基选用MS培养基（Murashige﹠Skoog(1962)）为基本培养基。5.1MS培养基母液的配制按MS培养基标准成分配制。配制母液时，大量元素、微量元素、铁盐各成分依次加热溶解后混合，冷却后定容，铁盐需装入棕色试剂瓶。各母液配制好后均放置在冰箱中4℃条件下保存，使用时根据培养基配制量取适量母液。5.2植物生长调节剂母液的配制植物生长调节剂配制成浓度为0.5mg/mL～1mg/mL的母液。配制时，先用1mL～2mL95%乙醇溶解（溶解IBA、NAA）或0.1mol/L的HCl（溶解6-BA、KT）溶解，再用无菌蒸馏水定容至所需浓度，摇匀后贮于棕色试剂瓶中，置于4℃冰箱中保存。5.3培养基的制备配制时，先将培养基基本成分（大量元素、微量元素、铁盐、有机物）按照需要量加入量筒中，再分别加入不同浓度需用量的各种激素，定容后加入糖和琼脂，放入蒸煮锅内煮开，用0.1mol/L的HCl或NaOH调节pH值至5.6～5.8，分装于试管或三角瓶等容器中，用封口膜（盖）封口，放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌。灭菌时工作压力稳定在1.1kg/cm2（0.105MPa），温度为121℃，灭菌时间20min。灭菌后置于试管架或存放架上冷却待用。6环境消毒和无菌操作6.1环境消毒接种前，提前30min开启无菌室室内和超净工作台紫外灯照射消毒，关灯后15min～20min工作人员方可进入室内操作。室内若有浮尘，可用75%乙醇或1%苯扎溴铵溶液（新洁儿灭消毒液）喷雾降尘。每天工作结束后，清扫地面，可用有效氯含量5%～6%的次氯酸钠（NaClO）溶液（84消毒液）500mg/L～1000mg/L，或将27g/L～33g/L苯扎溴铵溶液稀释10倍，或用50%多菌灵400倍液等交替进行地面消毒。DB14/T1515—20173接种服、工作帽、口罩、拖鞋等在消毒柜中消毒或用紫外灯照射消毒。操作所用的镊子、解剖刀、解剖针、培养皿等均需用纱布或牛皮纸包裹后，经过高压蒸汽灭菌，培养皿及滤纸可用牛皮纸包好置于鼓风干燥箱内200℃下灭菌2h。6.2无菌操作工作人员进入接种室前，需用肥皂清洗手臂，在更衣室穿好消毒过的接种服、工作帽、口罩和拖鞋（鞋套）。操作时用75%乙醇仔细擦拭双手、超净工作台台面。将镊子、接种刀等接种工具浸泡在95%乙醇中，使用前，在酒精灯外焰上灼烧灭菌后（也可用消毒器代替酒精灯），置于搁置架上冷却待用，在操作中接种工具要重复进行灭菌。7脱毒母株的获取7.1外植体选择外观无病毒症状的植株，以其饱满、无病虫害、无损伤的健康鳞茎为脱毒培养材料，取中心茎尖为外植体。7.2鳞茎灭菌用自来水冲洗鳞茎表面泥土，剥离鳞茎外层鳞片，以周长小于1cm的鳞茎为外植体，放入烧杯中，移至超净工作台上，先用75%乙醇（酒精）浸泡10s～30s，再用10%NaClO灭菌处理12min，之后用无菌水冲洗4～5次，再用无菌滤纸吸去表面水分，置于无菌培养皿中备用。7.3茎尖剥离将灭过菌的鳞茎置于40倍体式显微镜（双筒显微镜）下，用解剖针由外向内剥去鳞片，直至露出光滑的茎尖，用解剖刀切取0.5mm～1mm的茎尖，接种于MS+6-BA0.5mg/L～1.5mg/L+NAA0.1mg/L+3%蔗糖培养基中，封口后，在培养瓶壁上标注编号、接种日期等。7.4茎尖培养把接种后的培养瓶放在培养室内的光照培养架上进行培养。培养条件为温度(25±2)℃，光照强度2000Lx～3000Lx，光照时间14h～16h/d。培养30～40d后，可看到茎尖明显伸长且呈绿色，继续培养诱导茎尖萌动成苗。7.5试管苗病毒检测随机挑选100份百合茎尖脱毒苗，分别用DAS-ELISA或者TR-PCR法对其进行LSV、CMV和LMoV三种病毒的检测，按照NY/T1744-2009中的5.1、5.2、6.1、6.2和6.3的规定执行，筛选出无病毒的试管苗。8脱毒试管苗鳞茎的诱导和增殖8.1脱毒试管苗鳞茎的诱导病毒检测后获得的脱毒百合试管苗培养30d后，将增殖的芽丛切下，转入鳞茎诱导培养基。培养基成分为1/2MS基本培养基，附加NAA0.5mg/L～1.0mg/L，蔗糖浓度为60g/L～100g/L，pH5.6～5.8。DB14/T1515—2017430～40d后分化出小鳞茎。培养条件为培养温度（25±2）℃，光照强度2000Lx～3000Lx，光照时间14h～16h/d。8.2脱毒试管鳞茎扩繁将诱导产生的试管鳞茎接种于MS+6-BA0.2mg/L～1.0mg/L+NAA0.1mg/L～0.5mg/L+6%～10%蔗糖培养基中，诱导小鳞茎增殖。培养30～40d后，再转接于MS+ZT1.0mg～3.0mg/L+IBA0.5mg～1.0mg/L+8%～10%蔗糖培养基中，诱导鳞茎增殖膨大，获得健壮鳞茎，用于生根培养。培养条件同8.1。9脱毒试管鳞茎生根9.1试管鳞茎生根将增殖培养获得的脱毒鳞茎接种于1/2MS+NAA0.1mg～0.5mg/L+6%～10%蔗糖培养基中，诱导鳞茎生根。培养条件为温度（22±2）℃，光照强度2000Lx～3000Lx，光照时间14h～16h/d。9.2试管鳞茎出瓶标准试管内生根鳞茎直径达到0.5cm～1cm。9.3病毒检测脱毒试管鳞茎的抽样和病毒检测同7.5。10脱毒试管鳞茎的移栽10.1炼苗移栽前将达到出瓶标准的试管鳞茎放置于培养室黑暗处10～15d，移栽前1周置于温室闭瓶炼苗，移栽前2～3d温室开瓶炼苗。10.1移栽基质移栽基质用蛭石、沙、土1：2：3比例混合均匀，或用腐叶土、蛭石1：1比例混合基质，基质厚度10cm～15cm。10.2移栽技术温室移栽时，用清水将试管鳞茎根部的培养基洗干净后，植入移栽基质中，种植密度为100粒/m2～140粒/m2。移栽后，移栽基质一定要浇透水，并在其上搭建小拱棚，覆盖塑料薄膜和遮阳网，4周后去遮阳网，有新叶长出后，去塑料薄膜。移栽成活后，可作为脱毒籽球进行田间繁育或直接定植于大田栽培。5月～8月移栽可直接在大田进行，移栽步骤同上。_________________________________