DB41∕T 1733-2018 玉米中驸马毒素B1测定 荧光偏振免疫分析法

ICS65.020.20B20DB41河南省地方标准DB41/T1733—2018玉米中伏马毒素B1测定荧光偏振免疫分析法2018-11-26发布2019-02-26实施河南省质量技术监督局发布DB41/T1733—2018I目次前言............................................................................II1范围...............................................................................12规范性引用文件.....................................................................13原理...............................................................................14试剂...............................................................................15仪器...............................................................................26试样制备...........................................................................27分析步骤...........................................................................27.1提取...........................................................................27.2测定...........................................................................28计算...............................................................................39精密度.............................................................................39.1重复性.........................................................................39.2再现性.........................................................................3DB41/T1733—2018II前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由河南省农业厅提出并归口。本标准起草单位：河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，河南省农产品质量安全检测中心，延津县农产品质量安全检测站。本标准主要起草人：刘冬梅、刘继红、王红旗、余新华、李淑芳、尹海燕、马莹、张军锋、张迪、曹成、徐晋豫。DB41/T1733—20181玉米中伏马毒素B1的测定荧光偏振免疫分析法1范围本标准规定了玉米伏马毒素B1的测定荧光偏振免疫分析法。本标准适用于玉米中伏马毒素B1的测定。本标准的检测限为474.3µg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。3原理试样中用磷酸盐缓冲溶液提取的伏马毒素B1与伏马毒素抗体形成复合物。在溶液中加入伏马毒素B1荧光标记物，与伏马毒素B1竞争伏马毒素抗体，形成伏马毒素B1荧光标记物与伏马毒素抗体的复合物产生荧光偏振。通过测定荧光偏振强度计算伏马毒素B1含量。4试剂试剂中的用水应符合GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。4.1伏马毒素B1荧光标记物（6，-（4,6-二氯三嗪基）氨基荧光素标记的伏马毒素B1，6-DTAF）（伏马毒素B1荧光标记物的配置详见附录A）。4.2伏马毒素抗体（P2A5-3-F3）。4.3γ-牛血清球蛋白（γ-BGG），99%，CAS号9007-83-4。4.4甲醇(色谱纯)。4.5乙腈(色谱纯)。4.6伏马毒素B1标准品：晶体，纯度95%；或经过国家认证授予标准物质证书的标准物质。4.710mM磷酸盐缓冲溶液（PBS缓冲溶液）：其中含有10mM磷酸钠，0.15M氯化钠，pH=7.2。4.80.1%γ-BGG溶液：称取0.05gγ-BGG（4.3）溶解于50mL10mMPBS缓冲溶液中（4.7）。4.9伏马毒素B1荧光标记物储备液（100µg/mL）：取1mg伏马毒素B1荧光标记物（4.1），用甲醇（4.4）溶解，定容到10mL，储存与棕色瓶中，4℃保存。4.10伏马毒素荧光标记物使用液（0.4µg/mL）：取8µL伏马毒素B1荧光标记物储备液（4.9），加入到1992µLPBS缓冲溶液（4.7），储存于棕色瓶中。现配现用。4.11抗体溶液（4.0µg/mL）：抗体用0.1%γ-BGG溶液（4.8）稀释到浓度为4.0µg/mL。4.121000mg/L伏马毒素B1标准贮备液：称取10mg伏马毒素B1，用甲醇溶解，定容到10mL容量瓶中。-20℃冰箱中保存。DB41/T1733—201824.1350mg/L伏马毒素B1标准使用液：取75µL标准贮备液（4.12），加入到1425µLPBS缓冲溶液中，混匀。溶液浓度为50mg/L。现配现用。4.14伏马毒素B1标准工作液：分别准确吸取伏马毒素B1标准使用液（4.13）0.002mL、0.004mL、0.02mL、0.04mL、0.10mL、0.20mL、0.40mL、1.00mL、4.00mL于10mL的容量瓶中，用水定容，分别相当于10µg/L、20µg/L、100µg/L、200µg/L、500µg/L、1000µg/L、2000µg/L、5000µg/L、20000µg/L浓度标准工作液。4.15定性中速滤纸。4.16滤膜：0.22µm有机滤膜。5仪器5.1分析天平：感量±0.0001g、±0.01g；5.2振荡器；5.3涡旋混合器；5.4荧光偏振测定仪：具有荧光偏振功能的激发波长488nm、发射波长520nm的设备。6试样制备玉米：去除可见杂质，混匀，四分法缩分至约300g，粉碎后全部通过孔径425μm的标准筛，取约100g储于食品塑料袋或玻璃广口瓶内，通风良好处常温存放，备用。7分析步骤7.1提取称取20g样品（准确至0.01g），置于250mL具塞三角瓶中，加入100mLPBS缓冲溶液（4.2.1），振荡器上震荡1h。用滤纸过滤，滤液采用0.22µm的滤膜过滤，滤液待测定用。7.2测定7.2.1荧光偏振强度测定在试管中依次加入900µL磷酸盐缓冲溶液、100µL伏马毒素B1标准工作液或样品滤液、100µL抗体溶液，在涡旋混合器上混匀，放入荧光偏振测定仪中，测定。取出试管，加入100µL伏马毒素B1荧光标记物溶液，在涡旋混合器上，混匀，放入荧光偏振测定仪中，反应1min，测定。记录测定得到的荧光偏振强度。7.2.2标准曲线绘制将配制好的伏马毒素B1标准工作液（4.14）按照7.2.1测定方法测定不同浓度标准溶液的荧光偏振强度，以伏马毒素浓度（µg/mL）—荧光偏振强度（mP）作标准曲线。7.2.3样品溶液的测定按照7.2.1测定样品溶液的荧光偏振强度，根据标准曲线得到待测液中伏马毒素B1的浓度，样品中伏马毒素B1浓度应在标准工作曲线浓度范围内。DB41/T1733—20183mVcX8计算试样中伏马毒素B1含量按式（1）计算：..........................................……………………（1）式中：X——试样中伏马毒素B1的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；c——从标准曲线上得到的待测液中伏马毒素B1的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V——试样中加入的提取溶液体积，单位为毫升（mL）样；m——试样的质量，单位为克（g）；以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，计算结果保留两位有效数字。9精密度9.1重复性在重复性条件下，两次独立测定结果的相对标准偏差不得超过20%。9.2再现性在再现性条件下，两次独立测定结果的相对标准偏差不得超过的30%。DB41/T1733—20184附录A(规范性附录)溶液配制伏马毒素B1荧光标记物（6，-（4,6-二氯三嗪基）氨基荧光素标记的伏马毒素B1，6-DTAF）的配制称取10mg伏马毒素B1，加入0.1mL二甲基甲酰胺，再加入0.1mL0.1MNa2CO3溶液，混匀。称取1mg6-DTAF，加入0.1mL二甲基甲酰胺，混匀。将6-DTAF溶液加入到伏马毒素溶液中，搅拌反应8h。将反应液移入加有0.3g硅胶60（粒径20µm～43µm，用二氯甲烷洗涤并干燥后使用）的小瓶中，用0.4mL甲醇洗涤反应瓶2～3次，洗涤液并入小瓶中，用冷冻干燥机干燥过夜。荧光标记物的纯化采用填充柱净化，柱填料为硅胶60（粒径40µm～63µm）。将约10g填料溶解于二氯甲烷中，搅拌赶除气泡后，将溶液倾倒入填充柱中，静置待填料沉淀。样品用10mL甲醇溶解，倾入柱中，分别用50mL二氯甲烷和50mL淋洗液（二氯甲烷、甲醇和乙酸按30:10:0.5的比例混合）洗涤，最后用60mL洗脱液（二氯甲烷、甲醇和乙酸按30:30:1的比例混合）洗脱，收集洗脱液。40℃水浴减压旋转蒸发近干，冷冻干燥机干燥过夜至荧光标记物为黄色粉状物。收集荧光标记物于瓶中，在-20℃条件下保存。_________________________________