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ICS65.120B46DB41河南省地方标准DB41/T1589—2018饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的检测EMA-PCR法2018-04-17发布2018-07-17实施河南省质量技术监督局发布DB41/T1589—2018I前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由河南省畜牧局提出并归口。本标准起草单位：河南省兽药饲料监察所、郑州中道生物技术有限公司。本标准主要起草人：宋志超、狄元冉、方春芳、李灵平、陈小鸽、于辉、刘素梅。本标准参加起草人：高延玲、方忠意、李金磊、董鹏、宋善道、曾萍、李博、朱雷、张杰、司慧民、张盼盼、范念亭。DB41/T1589—20181饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的检测EMA-PCR法1范围本标准规定了饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的EMA-PCR检测方法。本标准适用于饲料中单核细胞增生李斯特氏菌的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.30食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样3原理叠氮溴化乙锭（EMA）能够透过死细菌的细胞膜，在强光照射下可与其DNA发生不可逆转的结合，使死细菌DNA不能作为模板进行PCR扩增，而活菌能进行PCR扩增。4试剂和材料4.1除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，试验用水符合GB/T6682一级水的要求。4.2李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2）：见附录A的A.1。4.32×PremixTaq缓冲液：内含TaqDNA聚合酶1.25U/25μL，4mmolMg2+，dNTP各0.4mmol。4.4特异性引物(对)序列为：a）上游引物：5＇-GATGACGAAATGGCTTACAGTGAAT-3＇；b）下游引物：5＇-CCACACTTGAGATATATGCAGGAGG-3＇。4.5琼脂糖：电泳级。4.6Marker2000。4.7单核细胞增生李斯特氏菌ATCC19114。4.850×TAE缓冲液：见附录A的A.2。4.96×上样缓冲液：见附录A的A.3。4.10叠氮溴化乙锭（EMA，0.2mg/mL）：见附录A的A.4。4.11溴化乙锭（10mg/mL）。4.12灭菌离心管：1.5mL，15mL。5仪器设备DB41/T1589—201825.1PCR仪。5.2天平：感量0.01g。5.3电热恒温培养箱。5.4离心机：转速≥12000r/min。5.5浊度仪。5.6卤素灯：照度≥25000勒克斯（Lux）。5.7核酸电泳仪。5.8凝胶成像系统。5.9微量移液器：0.5μL～10μL，10μL～100μL，100μL～1000μL，1mL～10mL。5.10涡旋仪。6样品采集与制备按GB/T14699.1的规定采样，将样品充分混匀后密封低温保存，整个过程避免人为污染。7检验步骤7.1增菌取25g试样于225mL李氏增菌肉汤LB1（4.2）中，充分混匀，30℃±1℃培养24h±2h。取0.1mL预增菌液转移至10mL李氏增菌肉汤LB2（4.2）中，30℃±1℃培养24h±2h。如果试样量不足25g，试样质量与增菌液的体积比应为1∶9。7.2模板的制备取1mL增菌液至离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。加入1mL灭菌水悬浮沉淀物，12000r/min离心2min，弃上清，重复洗涤一次。加适量灭菌水悬浮沉淀物并调节菌悬液浓度至0.5麦氏单位（MCF）。取0.2mL菌悬液至离心管中，加入1.0μLEMA溶液（4.10）混匀，避光孵育5min。将离心管开盖置于冰上，卤素灯照射下曝光1min，然后水浴煮沸15min，再将离心管转移至冰浴中使其快速冷却15min。涡旋混匀裂解物，12000r/min离心2min，收集上清液，作为PCR扩增的模板（模板制备可选用等效的商品化试剂盒）。检测过程中分别设阳性对照和阴性对照，用添加单核细胞增生李斯特氏菌阳性标准菌株的样品作为阳性对照，用不含单核细胞增生李斯特氏菌的样品作为阴性对照。7.3PCR扩增采用50μL反应体系：2×PremixTaq缓冲液（4.3）25μL，模板5μL，浓度为20μmol/L的上、下游引物各1μL，灭菌水18μL。反应程序为：95℃预变性5min；35个循环：95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s；72℃终延伸5min后4℃保存。7.4电泳检测PCR扩增产物称取1.5g琼脂糖（4.5）加入100mL1×TAE电泳缓冲液（4.8）中，加热使其充分熔化，冷至65℃左右，加入5μL溴化乙锭（4.11），充分混匀，根据需要在模板内放入合适的梳子，倒入凝胶制成约5mm厚的胶块。在电泳槽中加入适量1×TAE缓冲液，使液面没过凝胶2mm左右。取PCR扩增产物5μL～8μLDB41/T1589—20183与1μL6×上样缓冲液（4.9）加入到上样孔内，设Marker2000（4.6）对照。5V/cm～8V/cm恒压下电泳20min～30min。电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中观察结果。8结果判定8.1结果分析条件设定如果单核细胞增生李斯特氏菌阳性对照的PCR产物在271bp处出现条带（参见附录B），同时阴性对照PCR产物于271bp处未出现条带，则检测结果成立；否则结果无效，应重新进行检测。8.2阳性判定样品的PCR产物电泳后在271bp处出现条带，则为疑似阳性样品，此时需按GB4789.30进行确证，最终结果以后者检测结果为准。8.3阴性判定样品的PCR产物电泳后在271bp处未出现条带，判定25g样品中未检出单核细胞增生李斯特氏菌。DB41/T1589—20184AA附录A（规范性附录）培养基和试剂A.1李氏增菌肉汤（LB1，LB2）A.1.1成分胰胨5.0g多价胨5.0g酵母膏5.0g氯化钠20.0g磷酸二氢钾1.4g磷酸氢二钠12.0g七叶苷1.0g水1000mLA.1.2制法将上述成分加热溶解，调节至pH7.2±0.2，121℃高压灭菌15min。A.1.2.1李氏增菌肉汤LB1每225mL中加入：1%萘啶酮酸（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）0.5mL1%吖啶黄（用无菌水配制）0.3mLA.1.2.2李氏增菌肉汤LB2每200mL中加入：1%萘啶酮酸0.4mL1%吖啶黄0.5mLA.250×TAE电泳缓冲液A.2.1成分三羟甲基氨基甲烷（Tris）242.0g乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H2O）37.2g冰乙酸57.1mL灭菌水942.9mLA.2.2制法Tris和乙二胺四乙酸二钠溶于800mL灭菌水，充分搅拌均匀；加入冰乙酸，充分溶解；用1mol/LNaOH调节至pH8.3，定容至1L后，室温保存。使用时稀释50倍即为1×TAE电泳缓冲液。A.36×上样缓冲液DB41/T1589—20185A.3.1成分溴酚蓝0.5g二甲苯氰FF0.5g0.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA，pH8.0）0.06mL甘油360mL灭菌水640mLA.3.2制法0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶于500mL灭菌水中，加入溴酚蓝和二甲苯氰FF溶解，与甘油混合，定容至1000mL，分装后4℃保存。A.4叠氮溴化乙锭（EMA）A.4.1成分叠氮溴化乙锭5mg灭菌水25mLA.4.2制法5mg叠氮溴化乙锭溶于5mL灭菌水中，定容至25mL，充分混匀，分装后-20℃避光保存。DB41/T1589—20186BB附录B（资料性附录）单核细胞增生李斯特氏菌活菌EMA-PCR扩增电泳图单核细胞增生李斯特氏菌活菌EMA-PCR扩增电泳图参见B.1。说明：M—Marker2000；1—阴性对照；2—阳性对照。图B.1单核细胞增生李斯特氏菌活菌EMA-PCR扩增电泳图_________________________________