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ICS65.020.01B07DB41河南省地方标准DB41/T1562—2018金银花指纹图谱检测规程2018-03-14发布2018-06-14实施河南省质量技术监督局发布DB41/T1562—2018I前 言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由河南省中医管理局提出并归口。本标准主要起草单位：河南省中医药研究院、河南省标准化研究院、河南省封丘县农村科技开发中心。本标准主要起草人：刘长河、王艳艳、李华妮、赵国敏、许书军、葛文静、郭国安。本标准参加起草人：党洁、徐钰佳、任孝德、刘方洲、李开言。DB41/T1562—20181金银花指纹图谱检测规程1范围本标准规定了金银花指纹图谱检测的术语和定义、原理、试剂与试药、仪器设备、检测方法、判定等。本标准适用于河南产金银花的高效液相色谱法指纹图谱检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1金银花指纹图谱金银花经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示金银花特性的共有峰的图谱。2.2相似度供试品图谱与对照指纹图谱相似的程度。2.3特征色谱峰色谱中具有一定特征的色谱峰。3原理样品经过50%甲醇提取，利用乙腈，磷酸、醋酸混合酸溶液梯度洗脱，以高效液相色谱法在240nm波长下测定样品溶液的指纹图谱，根据样品与金银花的对照标准图谱的相似度进行比较，参照中药指纹图谱相似度评价软件计算样品的相似度（国家药典委员会），根据相似度评价金银花的真伪、优劣。4试剂与试药4.1乙腈：色谱纯。4.2磷酸：分析纯。4.3醋酸：分析纯。4.4甲醇：分析纯。4.50.03%磷酸、0.3%醋酸溶液：吸取磷酸0.3mL、醋酸3mL至加有900mL水的量瓶中，用水定容至1000mL。4.6水：GB/T6682规定的实验用一级水。4.7标准品：绿原酸（CASNO327-97-9，纯度≥98%）；木犀草苷（CASNO5373-11-5，纯度≥98%）。4.8参照物溶液：精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇制成每1mL含0.05mg的溶液。DB41/T1562—201824.9混合对照品溶液：精密取绿原酸、木犀草苷对照品，加甲醇制成每1mL分别含绿原酸0.05mg、木犀草苷0.01mg的混合溶液，作为对照品溶液。4.10金银花（LonicerajaponicaThunb.）5仪器设备5.1高效液相色谱仪（紫外检测器）。5.2色谱柱（十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；4.6mm×250mm5µm或相当者）。5.3电子分析天平（十万分之一）。5.4数控超声波清洗器（功率250W，频率50kHz）。6检测方法6.1参照物及对照品溶液的制备称取绿原酸对照品，加甲醇制成每1mL含0.05mg的溶液作为参照物溶液，在10℃以下保存；再取绿原酸、木犀草苷对照品，加甲醇制成每1mL分别含绿原酸0.05mg、木犀草苷0.01mg的混合溶液，作为对照品溶液。6.2供试品溶液的制备取金银花粉末（60目）0.5g(千分之一)，称定重量，置具塞锥形瓶中，精密加50%甲醇溶液100mL，称定重量，超声处理30min，称重，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45µm微孔滤膜滤过，即得。6.3测定6.3.1色谱条件——色谱柱：色谱柱（十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；4.6mm×250mm5µm或相当者）。——流动相：乙腈（A）-0.03%磷酸、0.3%醋酸溶液（B），梯度洗脱（0min～10min，6%A，0.9mL.min-1；10min～35min，6%～18%A，0.9mL.min～0.5mL.min-1；35min～36min，18%A，0.5mL.min-1；36min～70min，18%～32%A，0.5mL.min-1）。——柱温：40℃。——进样量：10µL。——指纹图谱检测波长：240nm。6.3.2指纹图谱测定分别精密吸取绿原酸参照物溶液、金银花样品溶液，按6.3.1色谱条件检测，记录0min～60min的色谱图。对金银花的色谱峰进行积分，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版建立参照物绿原酸以及金银花对照模板，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统B版（国家药典委员会）计算各样品的相似度。7判定7.1在相同实验条件下，将样品指纹图谱与绿原酸参照物图谱、对照品图谱及金银花对照指纹图谱进行比较，典型的对照指纹图谱见附录A。DB41/T1562—201837.2金银花等级判定见表1。表1金银花等级判定等级性状指纹图谱一等花蕾呈棒状，上粗下细、略弯曲。表面绿白色，花冠厚，质稍硬，握之有顶手感。气清香，味甘微苦。无开放花朵，破裂花蕾及黄条不超过5%（w/w）。无黑条、黑头、枝叶、杂质、虫蛀、霉变。相似度不小于90%；显绿原酸、木犀草苷峰。二等开放花朵不超过5%（w/w），破裂花蕾及黄条不超过10%（w/w），无黑条、枝叶。其他标准同一等。相似度不小于90%；显绿原酸、木犀草苷峰。三等开放花朵、黑条不超过30%（w/w），无枝叶。其他标准同一等。相似度大于或等于80%小于90%；显绿原酸、木犀草苷峰。四等花蕾和开放花朵兼有，色泽不分。枝叶不超过3%（w/w）。无杂质、虫蛀、霉变。相似度大于或等于60%小于80%等外花蕾和开放花朵兼有，色泽黑暗。枝叶超过3%（w/w）。无杂质、虫蛀霉变。相似度小于60%7.3共有指纹峰的标定根据指纹图谱技术要求，以药材相对保留时间均值标定共有指纹峰，与参照物绿原酸保留时间相对应的峰为S峰，计算特征色谱峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5%之内。规定值为：0.88（峰1）、1.00(峰S)、1.07（峰2）、1.18(峰3)、1.27(峰4)、1.62(峰5)、1.98(峰6)、2.12(峰7)、2.25(峰8)、2.30(峰9)、2.35(峰10)、2.40（峰11）、2.44（峰12）、2.54(峰13)、2.60(峰14)、2.63(峰15)、2.69(峰16)、2.93(峰17)、2.98(峰18)、3.15(峰19)。7.4共有指纹峰面积的比值以药材峰面积的比值确定共有指纹峰面积的比值。与参照物绿原酸保留时间相对应的峰为S峰，计算特征色谱峰峰面积与S峰峰面积的相对峰面积。部分批次的第16个峰的峰面积占总峰面积在10%～20%；部分在20%以上，根据指纹图谱技术要求，峰面积差值范围为：（4）：（6）：（7）：（16）：S=(0.403～1.011)：（0.117～0.569)：（0.222～1.319）：（0.655～1.432)：（1.000）。DB41/T1562—20184AA附录A（规范性附录）典型对照图谱A.1金银花对照指纹图谱见图A.1。图A.1金银花对照指纹图谱A.2参照物（绿原酸）图谱见图A.2。图A.2参照物（绿原酸）图谱DB41/T1562—20185A.3绿原酸、木犀草苷对照品图谱见图A.3。图A.3绿原酸、木犀草苷对照品图谱A.4等外品金银花对照指纹图谱见图A.4。图A.4等外品金银花对照指纹图谱注1：相似度评价软件A版、B版：国家药典委员会（）。注2：典型对照图谱电子数据：河南省中医药研究院（“资料下载”）。_________________________________