DB61∕T 1134-2018 番茄黄化曲叶病毒检验鉴定方法

ICS65.020.01B16DB61陕西省地方标准DB61/T1134—2018番茄黄化曲叶病毒检验鉴定方法DetectionandidentificationofTomatoyellowleafcurlvirus2018-04-10发布2018-05-10实施陕西省质量技术监督局发布DB61/T1134—2018I目次前言............................................................................................................................................................II1范围..............................................................................................................................................................12规范性引用文件..........................................................................................................................................13番茄黄化曲叶病毒基本信息......................................................................................................................14方法原理......................................................................................................................................................15实验用仪器设备、用具及试剂..................................................................................................................16取样和样品制备..........................................................................................................................................27检测方法......................................................................................................................................................28结果判定......................................................................................................................................................29结果记录与样品、资料保存......................................................................................................................210安全............................................................................................................................................................3附录A（规范性附录）TYLCV相关资料..................................................4附录B（规范性附录）双抗体夹心酶联免疫吸附测定方法..................................7附录C（规范性附录）普通PCR检测方法...............................................11附录D（规范性附录）实时荧光PCR检测方法...........................................14附录E（规范性附录）生物学接种.....................................................16DB61/T1134—2018II前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由陕西省农业厅提出并归口。本标准起草单位：陕西省生物农业研究所、陕西省园艺蚕桑技术工作站、陕西学前师范学院。本标准主要起草人：李英梅、杨苗苗、王周平、刘晨、张伟兵、张锋、洪波、陈志杰、张淑莲。本标准由陕西省生物农业研究所负责解释。本标准首次发布。联系信息如下：单位：陕西省生物农业研究所电话：029—82291059地址：西安市咸宁中路125号邮编：710043DB61/T1134—20181番茄黄化曲叶病毒检验鉴定方法1范围本标准规定了番茄黄化曲叶病毒酶联免疫吸附DAS-ELISA、普通PCR、实时荧光定量PCR检测方法。本标准适用于番茄种苗及传毒介体中携带的番茄黄化曲叶病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489-2008实验室生物安全通用要求GB/T23629-2009引进植物病原生物安全控制技术要求3番茄黄化曲叶病毒基本信息中文名：番茄黄化曲叶病毒英文名：tomatoyellowleafcurlvirus英文缩写：TYLCV分类地位：双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）番茄黄化曲叶病毒其他信息见附录A。4方法原理通过基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附DAS-ELISA、普通PCR、实时荧光定量PCR进行检测鉴定。5实验用仪器设备、用具及试剂5.1仪器设备酶联检测仪、洗板机、高速冷冻离心机、PCR仪、荧光定量PCR仪、电子天平（感量，1/10000g）、电泳仪、电泳槽、紫外投射仪、凝胶成像系统、恒温水浴、低温冰箱、液氮罐、隔离温室等。5.2用具可调式微量移液器（0.5μL、2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）、96孔光化学PCR反应板、酶联板、离心管、PCR管、研钵等。5.3试剂酶联测定试剂，PCR检测试剂，除有特殊说明外，均为分析纯或生化试剂。DB61/T1134—201826取样和样品制备6.1取样6.1.1疑似被TYLCV感染的番茄植株取样方法：取疑似发病植株顶部叶片2片～3片，-20℃储存备用。6.1.2无TYLCV感染症状番茄植株取样方法：在番茄田随机选5点，每点随机选5株，每株取顶部叶片2片～3片，-20℃储存备用。6.1.3若在取样过程中发现烟粉虱，应随机采集烟粉虱，-20℃储存备用。6.2实验室样品制备6.2.1植物样品：将每份10g待测番茄叶片放入研钵后加入液氮研磨，取100mg按照植物基因组试剂盒抽提番茄叶片总DNA，-20℃保存所提DNA。6.2.2烟粉虱样品：取单头烟粉虱按照动物基因组提取试剂盒抽提DNA，-20℃保存所提DNA。7检测方法7.1酶联免疫吸附测定方法见附录B。7.2PCR检测方法见附录C。7.3实时荧光定量PCR检测方法见附录D。7.4生物学测定方法见附录E。8结果判定8.1样品经酶联免疫吸附、普通PCR、实时荧光定量PCR三种方法之一检测为阴性时，判定样品不携带TYLCV。8.2普通PCR、实时荧光定量PCR中的两种方法检测结果为阳性，应进行序列测定，如序列测定结果证实与所检测的TYLCV一致，即可判定检出TYLCV。8.3酶联测定为阳性后，普通PCR或实时荧光PCR检测结果为阳性可判定检出TYLCV。必要时可进行生物学测定，并进行复检。9结果记录与样品、资料保存9.1结果记录检验结果应形成检验报告，内容包括取样品种、时间、地点、人员、样品类型，样品保存条件；实验时间、地点、方法、结果，检验人员签字等。9.2样品保存经检验确定携带TYLCV的样品保存在-80℃冰箱，标记样品并登记。9.3资料保存酶联测定需有酶联极反应的原始数据，普通PCR检测需有电泳结果照片及序列测定报告，荧光定量PCR检测需有扩增曲线图片，生物学测定需有鉴别寄主的症状图片。DB61/T1134—2018310安全实验过程中的生物安全要求应严格按照GB19489-2008的规定进行操作，实验废弃物按照GB/T23629-2009中相关要求进行处理。DB61/T1134—20184AA附录A（规范性附录）TYLCV相关资料A.1生物学特性A.1.1主要寄主作物TYLCV的自然寄主有番茄（LycopersicumesculentumMill.）、烟草（Nicotianatabacum）、茄子（Solanummelongena）、南瓜（Cucurbitamoschata）、木薯（Manihotesculentacrantz）、棉花（Gossypiumhirsutum）、辣椒（CapsicumannuumL.）等。A.1.2野生寄主野生寄主有曼陀罗（Daturastramonium）等。A.1.3病毒侵染部位茎秆、叶片、果实。A.2病害症状A.2.1番茄受害症状：寄主植株感染TYLCV后，初期主要表现生长迟缓或停滞，顶部叶片常退绿发黄，变小变厚，叶质脆硬，叶片有褶皱、向上卷曲，叶片边缘至叶脉区域黄化节间变短，植株明显矮化，下部老叶症状不明显（见图A.1、图A.2）；番茄植株具有明显曲叶症状外，后期表现坐果少，果实变小，膨大速度慢，成熟期的果实不能正常转色，果实产量和商品价值均大幅度下降。A.2.2烟草受害症状：寄主植株感染病毒后，株叶脉增粗叶片脊面出现耳突，叶片有卷曲、黄化现象。A.2.3辣椒受害症状：植株受害后，叶片卷曲、黄化。图A.1TYLCV侵染后的番茄叶片DB61/T1134—20185图A.2TYLCV侵染后的番茄植株A.3分布区域TYLCV主要分布于亚洲、非洲、欧洲、美洲、大洋洲。A.4传播方式烟粉虱（Bemisiatabaci）是唯一的传播媒介，各种生物型的烟粉虱均可传播。A.5粒体形态番茄黄化曲叶病毒粒体呈孪生颗粒状，大小约30nm×20nm。A.6基因组为单链环状DNA，大小约为2.8kb，基因数6个，基因组含有4个ORFs（AC1，AC2，AC3，AC4）。DB61/T1134—20186BB附录B（规范性附录）双抗体夹心酶联免疫吸附测定方法B.1材料B.1.1酶联板的要求使用有质量保证厂商生产的酶联板。B.1.2包被抗体特异性的TYLCV抗体。B.1.3酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的TYLCV抗体。B.1.4底物对硝基苯磷酸二钠（ρNPP）。B.1.5样品抽提缓冲液。样品抽提缓冲液（pH7.4）应符合表B.1。表B.1样品抽提缓冲液试剂用量亚硫酸钠（Na2SO3）1.30g聚乙烯基吡咯烷酮（PVP，MW24000～MW40000）20.0g叠氮化钠（NaN3）0.20g吐温（Tween-20）20mL注：溶于900mL，1×PBST中，NaOH或HCl调节pH值至7.4，定容至