DB14∕T 1403-2017 黄芩种子I∕TS2 序列鉴定方法

ICS65.020.20B05DB14山西省地方标准DB14/T1403—2017黄芩种子ITS2序列鉴定方法2017-05-30发布2017-07-30实施山西省质量技术监督局发布DB14/T1403—2017I目  次前言.....................................................................................................................................................................II1范围.................................................................................................................................................................12规范性引用文件.............................................................................................................................................13术语和定义.....................................................................................................................................................14原理.................................................................................................................................................................15试剂与材料.....................................................................................................................................................16黄芩种子ITS2序列特征...............................................................................................................................37种子扦样.........................................................................................................................................................38种子处理.........................................................................................................................................................39种子DNA提取方法.........................................................................................................................................310扩增与测序...................................................................................................................................................411序列拼接.......................................................................................................................................................412结果判断.......................................................................................................................................................5参考文献...............................................................................................................................................................6DB14/T1403—2017II前  言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山西农业大学提出并归口。本标准起草单位：山西农业大学。本标准主要起草人：宋芸、乔永刚、冯前进、刘根喜、王立。DB14/T1403—20171芩种子ITS2序列鉴定方法1范围本标准规定了黄芩种子ITS2序列鉴定的术语和定义、原理、试剂与材料、黄芩种子ITS2序列特征、种子扦样、种子处理、种子DNA提取方法、扩增与测序、序列拼接与结果判断。本标准适用于黄芩种子ITS2序列鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1ITS2序列在黄芩的rDNA基因中，5.8SrDNA和28SrDNA基因间隔序列称为内部转录间隔区2(ITS2)。4原理由于不同植物物种的ITS2核苷酸序列有差异，而同一物种不同植株间ITS2核苷酸序列保守，因此可以采用PCR扩增与测序技术对黄芩与非黄芩种子进行判断。5试剂与材料5.1琼脂糖5.2抗坏血酸钠5.3β-巯基乙醇5.4聚乙烯吡咯烷酮（PVP）5.510g/L溴化乙锭（EB）溶液称取1.0g溴化乙锭（EB），溶解于100mL水中。EB有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。DB14/T1403—201725.610mol/L氢氧化钠溶液称取400.0g氢氧化钠（NaOH），加800mL水溶解后，再加水定容到1000mL。5.71mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（pH8.0）称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中，用盐酸（HCl）调pH至8.0，用水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.8500mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）称取186.1g，乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2），加入700mL水中，加入适量氢氧化钠溶液（5.6），加热溶解后，冷却至室温，再用氢氧化钠溶液（5.6）调pH至8.0，用水定容到1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.95mol/L氯化钠溶液称取292.2g氯化钠（NaCl），加800mL水溶解后，再加水定容到1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.102%CTAB提取液量取1mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（5.7）100mL，5mol/L氯化钠溶液（5.9）280mL，500mmol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（5.8）40mL和20gCTAB，溶解后，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.11TE缓冲液（pH8.0）分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液（5.7）和2mL乙二铵四乙酸二钠溶液（5.8），加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。5.12酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）溶液按体积比为25:24:1配制酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）5.1350×TAE缓冲液称取242.2g三羟甲基氨基甲烷，加入300mL水加热搅拌溶解后，加入100mL乙二铵四乙酸二钠溶液（5.8），用冰乙酸调pH至8.0，然后加水定容到1000mL。使用时用水稀释成1×TAE。5.14加样缓冲液称取250.0mg溴酚蓝，加入10mL水，在室温下溶解12h；称取250.0mg二甲基苯腈蓝，加10mL水溶解；称取50.0g蔗糖，加30mL水溶解，混合三种溶液，加水定容至100mL，在4℃下保存备用。5.15DNA分子量标准清楚的区分50bp～1000bp的DNA片段。5.16dNTPs混合溶液将浓度为10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四种脱氧核糖核苷酸等体积混合。DB14/T1403—201735.17TaqDNA聚合酶（5U/μL）及PCR反应缓冲液。5.18ITS2基因引物ITS2-F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′ITS2-R：5′–GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′5.19引物溶液用TE缓冲液（5.11）分别将上述引物稀释到10μmol/L。除非另有说明，以上试剂仅使用分析纯试剂和重蒸馏水。5.20PCR产物回收试剂盒6黄芩种子ITS2序列特征黄芩ITS2序列参照陈士林著《中国药典中药材DNA条形码标准序列》。黄芩ITS2序列长228bp，不同产地黄芩有不多于四个变异位点，分别为88、111倍点T-C变异，171倍点A-G变异，210倍点C-A变异。主导单倍型序列特征如下：CGCATCGCGTCGCCCCCCCTCGCACCACCTCGAGCGGTGCCATGTGGGGGGGGCGGAGATTGGCCCCCCGTGCGCCCCGGCGCGCGGCCGGCCCAAATGCGATCCCCCGGCGACGCACGCCCCGACAAGTGGTGGTTGTTTCCTCAACTCGCGTGCTGTCGTGTGCCAAGGCGTCGTCCGTTCAGGAGAGAATCGAAAGATGAGACCCAACGGCCATCGTGCCATCGA7种子扦样按照GB/T3543.2的要求进行。8种子处理黄芩种子表面经无水乙醇处理后，用中药材粉碎机或研磨仪粉碎，粉碎后颗粒直径小于1mm，取100mg粉末置于2mL离心管中备用。9种子DNA提取方法种子DNA提取方法如下：a)在有100mg粉末的离心管中加入1000μL65℃预热的2%CTAB提取液（5.10），加入1μLβ-巯基乙醇，另加入少许PVP干粉，金属浴65℃保温30min，其间颠倒混匀3次。14000r/min离心10min。b)取上清液转入另一个1.5mL的离心管，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（25∶24∶1），缓慢翻转混匀，在14000r/min离心10min。c)重复上述步骤一次。d)取上清液，加入2/3体积的－20℃预冷的异丙醇，置于－20℃30min。在4℃条件下14000r/min离心10min。DB14/T1403—20174e)弃上清，加入300Ml75%乙醇轻振荡，在4℃条件下12000r/min离心10min。弃上清，室温下静置并自然风干10min。f)将此沉淀加入100mL的