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ICS65.020.01B16DB41河南省地方标准DB41/T1422—2017蝴蝶兰建兰花叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法2017-07-07发布2017-10-07实施河南省质量技术监督局发布DB41/T1422—2017I前 言本标准参照SN/T2155—2008给出的规则编写。本标准由河南省农业科学院提出并归口。本标准起草单位：河南省农业科学院园艺研究所。本标准主要起草人：王利民、蒋卉、董晓宇、符真珠、张和臣、王慧娟、李艳敏。本标准参加起草人：高杰、张晶、袁欣。DB41/T1422—20171蝴蝶兰建兰花叶病毒实时荧光RT-PCR检测方法1范围本标准规定了蝴蝶兰建兰花叶病毒（Cymbidiummosaicvirus）实时荧光RT-PCR检测的术语和定义、方法原理、仪器、用具、试剂、引物和检测方法。本标准适用于蝴蝶兰植株建兰花叶病毒实时荧光RT-PCR的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改）适用于本文件。SN/T2155—2008建兰花叶病毒检测方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1建兰花叶病毒建兰花叶病毒（CymbidiumMosaicVirus，CymMV），为马铃薯X病毒属（Potexvirus）病毒，该病毒的分类地位、粒体结构、理化性质、基因组结构、传播方式参见附录A和SN/T2155—2008。4方法原理建兰花叶病毒为ssRNA病毒，通过反转录酶和DNA聚合酶的作用将RNA反转录为cDNA，针对核酸保守序列设计引物，对cDNA进行PCR扩增，分析PCR检测结果，可明确材料中是否含有病毒的核酸成分。采用实时荧光RT-PCR方法，可实时监测每次扩增中特异性序列扩增的目的片段累积量，荧光信号随时间变化形成一条曲线。通常在10个～15个循环的荧光值设定阈值和基线，荧光产生进入指数期、线性期和最终的平台期，依次可以在PCR反应处于指数期的某一点上来监测PCR产物的量。荧光强度首次超过设定阈值时PCR所需的循环次数为Ct值，与样本细胞中表达稳定、丰度较低的基因（内参基因，如Actin、GAPDH等）的Ct值进行相对定量分析，检测目的RNA片段的相对含量。5仪器、用具、试剂及引物5.1仪器实时荧光PCR仪（本检测方法适用于ABI、Bio-Rad、Roche的实时荧光PCR仪）、高速冷冻离心机、漩涡震荡仪、核酸蛋白测定仪、-20℃冰箱、-80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机等。5.2用具DB41/T1422—20172移液枪、移液枪头、离心管、PCR板、研钵等。5.3试剂所用试剂参见附录B。5.4引物蝴蝶兰建兰花叶病毒的实时荧光RT-PCR特异性引物为Cymv-F：5’-TGCCAGACGGTGCTATCGTA-3’、Cymv-R：5’-AGAAAGGTGGAAGAGGTCGTTG-3’，扩增获得目的片段大小为182bp。蝴蝶兰实时荧光RT-PCR内参引物为PeActin-F：5’-CTCTTTCACAACCACTGCGG-3’、PeActin-R：5’-TGGGCACCTAAATCTCTCAGC-3’，扩增获得目的片段大小为181bp。6检测方法6.1样品采集取蝴蝶兰的心叶叶尖部位5g作为待检测样品，所取得样品及时进行检测或-60℃以下低温保存。6.2RNA提取6.2.1加入1.5mLTrizol至2mL离心管中备用。6.2.2取1g～2g样品液氮速冻研磨后加入离心管中，快速混匀，漩涡震荡2min～3min。6.2.3加入300μL三氯甲烷，漩涡震荡混匀2min～3min，4℃条件12000r/min离心15min。6.2.4缓慢吸取850μL上清到新1.5mL离心管中，加入850μL异丙醇，颠倒数次混匀，-20℃静置2h左右。6.2.54℃条件，12000r/min离心10min；用枪头吸除上清，倒扣沥干余液1min左右。6.2.6加入70%酒精1mL，颠倒数次后，震荡仪25℃条件750r/min震荡30min。6.2.74℃条件，750r/min离心1min，用枪头吸除酒精；4℃条件，750r/min离心1min，用枪头吸除酒精，倒扣晾干1min左右。6.2.8加入494μLddH2O，轻弹离心管至DNA完全溶解。6.2.9加入5μLDNasebuffer（100×）和1μLDNase混匀，37℃温育60min，除去DNA。6.2.10加入500μLP/C，混匀漩涡震荡5min；4℃条件，12000r/min离心10min。6.2.11取上清液440μL至新1.5mL离心管，加入400μL异丙醇和40μLNaAC溶液，颠倒混匀数分钟，-20℃放置30min左右。6.2.124℃条件，12000r/min离心10min，用枪头吸除上清，倒扣在滤纸上1min左右。6.2.13按6.2.6操作。6.2.14按6.2.7操作。6.2.15加入50μLddH2O；完全溶解后，震荡仪25℃条件，750r/min震荡30min。6.2.16-20℃保存备用。6.3RNA浓度及纯度检测采用超微量分光光度计测定RNA浓度和纯度。RNA浓度检测结果应≥150ng/μL，RNA溶液的A260/A280的比值范围为1.8～2.1为宜,A260/A230的比值范围为2.0～2.4为宜。-20℃保存备用。6.4反转录DB41/T1422—201736.4.1采用cDNA合成试剂盒（可按商品试剂盒说明书操作）。取9μLRNA至新的1mL离心管中，加入1μL的Oligo（dT）和1μLdNTP，将试剂混合均匀。65℃反应5min，迅速转移至冰上骤冷。6.4.2采用cDNA合成试剂盒（可按商品试剂盒说明书操作）。将6.4.1的反应产物中，加入4μLPrimeScriptIIBuffe（5×）、3.5μLRnasefreeH2O、0.5μLRnaseInhibitor、1μLPrimeScriptIIRtase，试剂按比例混合均匀后分装。42℃反应60min，72℃反应5min，完成反转录过程。-20℃保存备用。6.5实时荧光RT-PCR反应6.5.1实时荧光RT-PCR反应体系以蝴蝶兰建兰花叶病毒重组质粒为阳性对照，以ddH2O为空白阴性对照，以PeActin引物组合为相对定量引物。Cymv引物的反应体系为：10μLSYBRGreenMix、0.8μLCymv-F和0.8μLCymv-R引物、2.4μL样品cDNA，补充ddH2O定容至20μL，混匀分装至PCR管中，短暂离心备用。PeActin引物的反应体系为：10μLSYBRGreenMix、0.8μLPeActin-F、0.8μLPeActin-R引物、2.4μL样品cDNA，补充ddH2O定容至20μL，混匀后分装至PCR管中，短暂离心备用。6.5.2实时荧光RT-PCR反应程序将制备好的样品置于实时荧光PCR仪上，设置95℃预变性1min；95℃变性10s，60℃退火延伸30s，39个循环（Cycle）；绘制溶解曲线设置65℃5s，95℃0.5c（Cycle）。仪器操作方法按仪器使用说明书执行。6.5.3实时荧光RT-PCR检测结果分析查看溶解曲线（图1）。溶解曲线为单峰时表明特异性扩增，溶解曲线为多峰时表明反应不成功，建议重新进行步骤6.5的操作。查看扩增曲线（图2）。扩增曲线包括荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段和平台期，为一条平滑的S型曲线。查看实时荧光RT-PCR检测相应的结果文件。查看Cymv和PeActin引物分别检测的样品时的Ct值；图1实时荧光RT-PCR溶解曲线DB41/T1422—20174图2实时荧光RT-PCR扩增曲线6.6结果判定6.6.1待测样品内参基因PeActin引物Ct值为18≤Ct≤20，Cymv引物Ct值为40时，判定结果为阴性。6.6.2待测样品内参基因PeActin引物Ct值为18≤Ct≤20，Cymv引物Ct值为≤35时，则判定结果为阳性。6.6.3待测样品内参基因PeActin引物Ct值为18≤Ct≤20，Cymv引物Ct值为35＜Ct＜40时，应重新进行测试。如果测试的Cymv引物Ct值为40时，则判定结果为阴性；如果重新测试的Cymv引物Ct值为35＜Ct＜40时，则判定结果为阳性。6.7样品的保存与试验记录所有样品保存于-60℃超低温冰箱，瓶苗保存于组培室中，盆栽苗保存于温室中以备复核。完整的试验记录：样品的来源、种类、取材时间、实验的时间、地点、方法和结果、样品保存位置、试验结果样品保存位置等，并要有经手人和实验人员的签字。实时荧光RT-PCR检测应有相应的结果文件。DB41/T1422—20175AA附录A（资料性附录）建兰花叶病毒A.1学名建兰花叶病毒Cymbidiummosaicvirus（CymMV）。A.2分类地位CymMV属线形病毒科（Aphaflexiviridae）马铃薯X病毒属（Potexvirus），ssRNA病毒。A.3粒体结构病毒颗粒呈线状，长度475nm，宽度13nm，螺旋对称，螺纹明显，螺距为2.8nm。CymMV粒体为核糖蛋白体，有一种结构蛋白（外壳蛋白）和基因组ssRNA组成。外壳蛋白的分子量为23.6kDa左右，有220个氨基酸组成。核酸为线性正义链ssRNA，分子量为2.5×106，大小约为6.3kb。A.4理化性质CymMV的紫外线最高吸收峰为266nm，最低峰246nm，沉降系数为113S，吸光度260/280=1.1～1.13，稀释限点5×10-5，钝化温度65℃～70℃。通过一次PEG沉淀，在蔗糖密度梯度离心后病毒成明显的条带。室温下粒体保毒期为7d～30d，汁液在有机溶剂中较稳定。A.5基因组结构CymMV的RNA基因组全长为6227bp，3’末端有poly（A）加尾，5’端有带帽结构，与马铃薯X病毒属类似。其基因组结构包括5个开放式阅读框（ORF），ORF1编码一个大小为160kDa的依赖RNA聚合酶，ORF2～ORF4编码一个分子量为26kDa/13kDa/10kDa的三基因连锁结构，ORF5编码24kDa的外壳蛋白。CymMV所编码的蛋白与马铃薯X病毒属其它成员编码的对应蛋白有很高的同源性。不同地理来源的CymMV基因序列亲缘关系很近，核酸序列的相似性达91%～99%，编码的蛋白基因核酸序列相似性达97.8%。A.6传播方式该病毒通过汁液、桃芽等刺吸式类害虫传播。DB41/T1422—20176BB附录B（资料性附录）蝴蝶兰建兰花叶病毒实时RT-PCR荧光检测试剂B.1RNA提取试剂B.1.175%酒精（DEPCddH2O配制）取75mL无水酒精，加入25mLDEPCddH2O，混匀备用。B.1.2三氯甲烷/水饱和酚（P/C）200mL三氯甲烷，加入200mL水饱和酚混匀静置，4℃保存。B.2RNA凝胶检测试剂B.2.10.5mmol/LEDTA18.61gNa2EDTA·2H2O,加入80mL的ddH2O，充分搅拌，用NaOH调节pH值至8.0（约2gNaOH），加入ddH2O定容至100mL，高温高压灭菌，室温保存。B.2.250×TAE242gTris碱，52.1mL冰乙酸，100mL0.5mmol/LEDTA(pH8.0)，加蒸馏水至1L，使用时加入蒸馏水稀释至1×TAE。_________________________________