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DBS13河北省地方标准DBS13/008—2017食品安全地方标准肉及肉制品中沙门氏菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法河北省卫生和计划生育委员会发布2017-11-08发布2018-02-01实施DBS13/008—2017Ⅰ前 言本标准按照GB/T1.1-2009规定的格式编写。本标准由河北省卫生和计划生育委员会归口。本标准于2017年11月8日首次发布。DBS13/008—20172食品安全地方标准肉及肉制品中沙门氏菌环介导等温扩增（LAMP）检测方法1范围本标准规定了肉及肉制品中沙门氏菌环介导等温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）检测方法。本标准适用于肉及肉制品中沙门氏菌的快速筛选检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.1食品安全国家标准食品微生物学检测总则GB4789.4食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3原理根据沙门氏菌属特有的靶序列invA基因设计的两对特殊的内、外引物和一对环引物，特异性识别靶序列上的六个独立区域，利用BstDNA聚合酶（BstDNApolymerase）启动循环链置换反应，在invA基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；加入SYBRGreenI染料，即可通过颜色变化观察判定结果。叠氮溴化丙锭(propidiummonoazide，PMA)染料能够嵌入细胞外DNA或者穿过非活性菌受损的细胞膜进入细胞进而嵌入其DNA内，但被阻隔在活性菌的完整细胞膜之外。嵌入非活性菌DNA的PMA染料能够在强光照射下通过叠氮基团与DNA进一步形成牢固的共价结合，使其不能在后续的LAMP反应中扩增，因而可在LAMP反应中消除来自于非活性菌的DNA对LAMP检测结果的影响。4仪器和设备除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：4.1冰箱：2℃～5℃，-20℃；4.2恒温培养箱：36℃±1℃，42℃±1℃；4.3均质器；4.4振荡器；4.5电子天平：感量0.1g；4.6二级生物安全柜；4.7高速台式离心机：5000r/min~16000r/min；4.8水浴锅或加热模块：63℃±1℃，80℃±1℃；4.9微量移液器（0.1μL~2.5μL；0.5μL~10μL；20μL~200μL；100μL~1000μL）和吸头；DBS13/008—201734.10无菌透明离心管：1.5mL；4.11PCR反应管（透明）；4.12水浴振荡器：220r/min，37℃±1℃；4.13卤素灯：500W。5试剂和材料除有特殊说明外，实验所用试剂均为分析纯或符合生化试剂标准；实验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。5.1缓冲蛋白胨水（BPW），见GB4789.4中A.1。5.2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液，见GB4789.4中A.2。5.3亚硒酸胱氨酸（SC）增菌液，见GB4789.4中A.3。5.4引物：根据沙门氏菌属特有的靶序列invA基因设计一套特异性引物，见表1。表1特异性引物序列引物种类引物名称核苷酸序列外引物1F35’-CGGCCCGATTTTCTCTGG-3’外引物2B35’-CGGCAATAGCGTCACCTT-3’内引物1FIP5’-GCGCGGCATCCGCATCAATA-TGCCCGGTAAACAGATGAGT-3’内引物2BIP5’-GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC-3环引物1LF5’-GGCCTTCAAATCGGCATCAAT-3’环引物2LB5’-GAAAGGGAAAGCCAGCTTTACG-3’5.510×BstDNA聚合酶缓冲液。5.6100mmol/LMgSO4。5.710mmol/LdNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）。5.8BstDNA聚合酶。5.9无菌去离子水。5.10PMA染料，20mM（1mgPMA添加98μL无菌去离子水制成溶液保存）。5.11SYBRGreenI染料，1000×（取1μL10000×SYBRGreenI染料，添加9μL无菌去离子水）。5.12本标准用做阳性对照的菌株为鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028标准菌株。6检测程序检测程序参见图1。DBS13/008—20174阳性阴性按照GB4789.4方法操作报告PMA的处理DNA模板的提取LAMP反应结果观察25g样品+225mLBPW样品处理1mL+SC10mL1mL+TTB10mL36℃±1℃8h~18h36℃±1℃18h~24h42℃±1℃18h~24h图1检验程序7操作步骤7.1前增菌按GB4789.4中5.1操作。7.2增菌按GB4789.4中5.2操作。7.3PMA的处理吸取增菌后的1mLSC和1mLTTB分别加入1.5mL无菌透明离心管中，各加入100µLPMA溶液，220r/min振荡，37℃±1℃避光保温10min。然后将离心管进行冰浴，同时置于500W卤素灯正下方，相距10cm~15cm，曝光10min。7.4DNA模板的制备根据实验室实际情况，可采用方法一或方法二制备DNA模板：DBS13/008—20175a)方法一（热裂解法）：从7.3中PMA处理过的SC和TTB增菌液中各取1mL分别放入另一1.5mL无菌透明离心管中，10000r/min离心2min，弃上清；加入灭菌生理盐水1mL混匀，10000r/min离心2min，弃上清；然后加无菌去离子水100µL混匀，置100℃煮沸5min，10000r/min离心2min，取上清即为DNA模板，放置-20℃保存，备用。b)方法二（试剂盒法）：7.3中PMA处理过的SC和TTB增菌液分别参照商品化试剂盒产品操作程序提取DNA模板。7.5LAMP反应7.5.1反应体系配制：分别采用7.4中SC和TTB增菌液提取的DNA模板，将沙门氏菌LAMP检测的反应体系中各试剂依次添加到PCR反应管中。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行相应调整。反应体系见表2。表2沙门氏菌LAMP检测的反应体系试剂终浓度体积（μL）10×BstDNA聚合酶缓冲液1×2.5100mmol/LMgSO46.0mmol/L1.510mmol/LdNTP混合物1.2mmol/L3.010μmol/LFIP（内引物1）1.8μmol/L4.510μmol/LBIP（内引物2）1.8μmol/L4.510μmol/LF3（外引物1）0.1μmol/L0.2510μmol/LB3（外引物2）0.1μmol/L0.2510μmol/LLF（环引物1）1.0μmol/L2.510μmol/LLB（环引物2）1.0μmol/L2.58000U/mLBstDNA聚合酶640U/mL2.0DNA模板—1.0无菌去离子水—0.57.5.2反应程序：将反应管中的反应体系混匀，置于63℃扩增40min，再置于80℃保温10min，终止反应。7.5.3对照：检验过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。以鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028纯培养物提取的DNA模板为阳性对照，以非沙门氏菌纯培养物提取的DNA模板为阴性对照，以无菌去离子水代替DNA模板为空白对照。7.6结果观察LAMP反应结束后，应于2min内在反应管加入1000×SYBRGreenI染料lμL，轻轻混匀，立即观察颜色变化。8结果判定和报告在空白对照和阴性对照反应管液体显示为橙色，阳性对照反应管液体显示为黄绿色的条件下：8.1阳性：若SC或TTB任一增菌液的反应结果显示为黄绿色，则判定25g样品中沙门氏菌初筛结果为阳性，应按照GB4789.4方法继续进行5.3分离、5.4生化试验和5.5血清学鉴定，必要时进行5.6血清学分型，综合生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g样品中检出或未检出沙门氏菌，根据血清学分型试验结果判定沙门氏菌的血清型。8.2阴性：若SC和TTB增菌液的反应结果显示均为橙色，则判定结果为阴性，可直接报告25g样品中未检出沙门氏菌。注：LAMP实验环境条件和过程控制应参照GB/T27403《实验室质量控制规范食品分子生物学检测》规定执行。