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ICS65.020.20B23备案号：54543-2017DB32江苏省地方标准DB32/T3274—2017紫甘薯种苗病毒检测技术规程TechnicalregulationforvirusdetectionofPurple-fleshedsweetpotatoseedlings2017-07-01发布2017-08-01实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T3274—2017I前 言本标准按GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求编写。本标准由江苏省农业科学院提出并归口。本标准起草单位：江苏省农业科学院粮食作物研究所。本标准主要起草人：边小峰、马佩勇、贾赵东、谢一芝、郭小丁、禹阳。DB32/T3274—20171紫甘薯种苗病毒检测技术规程1范围本标准规定了紫甘薯种苗的质量要求和检测方法。本标准适用于紫甘薯种薯（苗）繁育、生产、销售过程中的质量鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4406-1984种薯GB7413-2009甘薯种苗产地检疫规程NY/T402-2016脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程NY/T1200-2006甘薯脱毒种薯3术语和定义下列术语和定义适用本文件。3.1甘薯种苗sweetpotatoseedlings从育种家种子开始，经逐代繁殖增加种薯（苗）数量的种薯生产体系生产出来的种薯（苗）。分为育种家种子、原原种、原种、生产用种四个级别。3.2育种家种子breeder’sseed由育种者直接生产和掌握的原始种子，具有该品种的典型性和遗传稳定性，纯度100%，不带病毒和其他病虫害，产量及其他主要性状符合推广时的原有水平。3.3原原种pre-elite用育种家种子或典型品种的脱毒试管苗在防虫网室、温室条件下生产的符合质量标准的种薯（苗）。3.4原种elite用原原种作种薯，在良好隔离条件下生产的符合质量标准的种薯（苗）。DB32/T3274—201723.5生产用种certifiedseed用原种作种薯，在良好隔离条件下生产的符合质量标准的种薯（苗）。4缩略语甘薯羽状斑驳病毒（sweetpotatofeatherymottlevirus,SPFMV）。甘薯潜隐病毒（sweetpotatolatentvirus,SPLV）甘薯褪绿斑病毒（sweetpotatochloroticfecksvirus,SPCFV）5质量要求各级别种薯（苗）繁殖田中带病植株允许率应符合表1的要求。表1各级别种薯（苗）繁殖田中允许病毒检出率(%)种薯级别育种家种子原原种原种生产用种苗期00≤5.0≤10.0封垄前00≤3.0≤10.0收获前2周00≤2.0≤10.06检测方法6.1检测样本的选择6.1.1脱毒试管苗对每个单株进行检测。淘汰带毒单株，经检测确定无病毒的才继续扩繁。6.1.2育种家种子、原原种和原种于苗期、封垄前和收获前2周，在目测全田，淘汰显症苗的基础上，采用随机取样法，抽样数量为：面积小于等于0.1hm2，检验2点，每点100株；面积大于0.1hm2小于等于1hm2，检验5点，每点100株；超过1hm2面积，划出另一检验区，按本标准规定面积取样。病毒检测每株取茎蔓上、中、下部叶片各1片，24h内检测（见表2）。6.1.3生产用种于封垄前、收获前2周，在目测全田，淘汰显症苗的基础上，采用随机取样法，面积小于0.1hm2，检验2点，每点100株；面积大于0.1hm2小于等于1hm2，检验5点，每点100株；面积大于1hm2小于等于5hm2，检验10点，每点100株；超过5hm2面积，划出另一检验区，按本标准规定面积取样。取样方法同原种。见表2。注：在进行病毒检测时，原原种每5株混样；原种或生产用种混合后二次抽样，随机抽取10%～50%的混合样品检测，抽取样品最低数量为100株。DB32/T3274—20173表2各级别种薯（苗）繁殖田中在不同种植面积中的抽样数量种薯级别育种家种子原原种原种生产用种面积≤0.1hm22点2点2点2点0.1hm2＜面积≤1hm25点5点5点5点1hm2＜面积≤5hm2划出另一检验区，按本标准规定面积取样10点面积＞5hm2划出另一检验区，按本标准规定面积取样注：每点取样100株6.2酶联免疫检测法当单株苗展开叶达6片以上时进行检测，按株取其上、中、下部叶片用于酶联免疫检测，剩余植株部分继续生长。用酶联免疫检测法初检后，淘汰显阳性反应的单株。6.2.1样品制备将待测叶片用清水清洗干净，从每一样品叶片上各取一直径约1cm圆片，放入样品袋中，加入3mL抽提缓冲液充分研磨，4℃静置30min～40min，取澄清液点样。样品为块根时，催芽处理后取幼芽、叶制样。6.2.2检测步骤6.2.2.1点样将打好方格的硝化纤维素膜用TBS缓冲液处理后放在洁净的滤纸上，每个样品各吸取17uL上清液滴在膜上方格的正中，干燥15min～30min。同时设阳性、阴性和空白对照，可根据需要设置重复。6.2.2.2封闭将干燥后的膜浸泡在封闭缓冲液中，室温下摇床振荡1h(50r/min)。6.2.2.3孵育第一抗体及洗涤将膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的抗血清中，室温下摇床振荡过夜(50r/min)。用洗涤缓冲液洗膜3次，每次摇床振荡3min(100r/min)。6.2.2.4孵育第二抗体将膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的酶标抗体中，室温下摇床振荡1h(50r/min)。洗涤缓冲液洗膜3次，每次摇床振荡3min(100r/min)。6.2.2.5显色将膜置于NBT/BCIP底物溶液中，室温下摇床振荡孵育30min(50r/min)。6.2.2.6终止反应弃去底物溶液并用蒸馏水洗膜3次，每次摇床振荡3min(100r/min)。6.2.2.7阳性判断DB32/T3274—20174晾干后观察颜色反应，出现蓝紫色反应的样品为阳性。6.3指示植物检测确认通过酶联免疫检测法检测的健康株继续扩繁，经指示植物检测，指示植物不显症的才能确认为无毒种苗。经检测确认的健康种苗继续扩繁。6.3.1材料准备6.3.1.1将待检测的脱毒苗或种苗盆栽于防虫措施良好的温室中。6.3.1.2盆播指示植物——巴西牵牛（Ipomoeasetosa），花盆直径不小于10cm，每待检测样品及阳性对照各需生长健壮巴西牵牛5株。6.3.2嫁接巴西牵牛生长出1片～2片真叶时嫁接，以待检测样品茎蔓为接穗，巴西牵牛为砧木。将待检测样品茎蔓中下部茎段切成3段～5段，每个接穗带一个单芽及叶片，去叶后将底端削成楔形，插入巴西牵牛砧木切口内，封口膜扎紧。嫁接后白天保持气温26℃～36℃，相对湿度80%～90%，适当遮阴，嫁接成活后，给予充足光照。6.3.3阳性判断嫁接后2周～3周显症，在所有嫁接指示植物中只要有一株表现典型症状即为阳性。症状为：SPFMV羽状斑驳SPLV叶脉变黄SPCFV叶片褪绿斑DB32/T3274—20175AA附录A（资料性附录）斑点酶联免疫检测法（DOT-ELISA）所用试剂斑点酶联免疫检测法（DOT-ELISA）所用试剂所用化学试剂为分析纯级规格，用水为蒸馏水。A.1在羟甲基氨基甲烷（TBS）(pH7.5)TrisBase4.84g氯化钠（NaCl）58.44g叠氮钠（NaN3）0.40g溶于1990mL蒸馏水中，用盐酸（37%）调pH至7.5，定容至2000mL。洗涤缓冲液（T-TBS）1.0mL吐温-20（Tween-20）溶于2000mLTBS中。A.2抽提缓冲液亚硫酸钠（Na2SO3）0.2g溶于TBS中，定容至100mL。A.3封闭缓冲液（现用现配）脱脂奶粉0.50g粹通X-100（TritonX1-00）0.5mLTBS25mL先将脱脂奶粉溶于少量TBS中，再用TBS定容至25mL。加入TritonX-100混合均匀。A.4抗体稀释缓冲液脱脂奶粉1.00gTBS50mL先将脱脂奶粉溶于少量TBS中，再用TBS定容至50mL。A.5底物缓冲液（pH9.5）TrisBase6.05g氯化钠（NaCl）2.92g氯化镁（MgCl2·6H2O）0.51g叠氮钠（NaN3）0.05g溶于450mL蒸馏水中，用浓盐酸调pH至9.5，定容至500mL。DB32/T3274—20176A.6硝基蓝四唑盐（NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯（BCIP）储备液NBT储备液：NBT0.04g70%N,N-二甲基甲酰胺1.2mL混合均匀，4℃避光保存。BCIP储备液：BCIP0.02g70%N,N-二甲基甲酰胺1.2mL混合均匀，4℃避光保存。A.7底物溶液（现用现配）底物缓冲液25mLNBT储备液75uLBCIP储备液75uLDB32/T3274—20177BB附录B（资料性附录）紫甘薯种苗病毒检测报告样式检测人：检测单位盖章年月日________________________