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ICS07.100B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2743—2017动物源细菌抗菌药物敏感性检测Bacterialantimicrobialsusceptibilitytestingofanimalorigin2017-02-23发布2017-03-23实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2743—2017I前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本标准由辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心和中国兽医药品监察所联合提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心、中国兽医药品监察所本标准主要起草人：李欣南、韩镌竹、许彬、李洪伟、高红倩、韩春晓、高铎、武凤娇、苏葳艺、李永才、李香珍、宋立、张纯萍。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。DB21/T2743—20171动物源细菌抗菌药物敏感性检测1范围本标准规定了动物源细菌常见药物的微量肉汤稀释法药物敏感性试验所需的试剂和材料、仪器设备、操作步骤和质量控制。本标准适用于动物源非苛氧菌常见抗菌药物的微量肉汤稀释法药物敏感性试验。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理微量肉汤稀释法是定量检测某一抗菌药物对动物源细菌的体外抑菌活性的一种标准方法。在每块药敏板上，都设有一系列稀释浓度的抗菌药物试剂，及阳性对照和阴性对照，通过加入待检细菌的菌悬液，经一定时间的孵育后，用微生物鉴定药敏分析系统或肉眼判读的方法对药敏板条进行读数，经数据分析得到最小抑菌浓度（MIC）值。试剂和材料4试剂和材料4.1化学试剂除非另有说明，使用的试剂为分析纯或生化试剂，所有实验室使用的试剂等级应为不含微生物的分析纯试剂，试剂的选购、验收、储存应符合规定。4.2实验用水除非另有规定，实验用水应符合GB/T6682中三级水的规格。4.3琼脂培养基：见附录A中A.1。4.4Mueller-Hinton肉汤（M-H肉汤）培养基：见附录A中A.2。4.50.85%无菌生理盐水称取8.50g（精确到0.01g）分析纯氯化钠，加入1L蒸馏水溶解后12115min℃高压灭菌。4.6抗菌药物DB21/T2743—20172使用标准品或对照品，参照中华人民共和国兽药典或CLSI的M07-A10、M37-A3和M45-A3进行溶解。4.7药敏检测板按产品说明进行操作使用。4.8质控菌株应选用来自国家级微生物菌种保藏中心的标准菌株或具有资质的菌种保藏机构提供的分类明确的菌株。质控菌株的使用代次为3~5代，质控菌株应至少30天更换一次，由冻干或超低温冷冻保存菌种移种或购买新菌种。5仪器设备5.1恒温培养箱：精度36±1℃。5.2分析天平：感量为0.01g和0.00001g。5.3无菌操作台：可满足无菌要求的生物安全柜、超净台或无菌室等。5.4多道移液器：量程20~200μL、100~1000μL、1000~10000μL。5.5麦氏比浊仪：量程0～5MCF。5.6自动加样器。5.7药敏结果判定仪。6测定程序动物源细菌抗菌药物敏感性检测程序见图1。图1动物源细菌抗菌药物敏感性检测程序图DB21/T2743—201737操作步骤7.1菌落培养接种的菌落由新鲜的划线平板菌落来制备，按要求选择琼脂培养基平板进行接种，除特殊要求培养时间不超过24小时。7.2菌液制备用接种环挑取琼脂平板上培养16～18小时的3～5个单菌落，用0.85%无菌生理盐水或M-H肉汤稀释至0.5麦氏单位，菌液浓度约为1～2×108CFU/mL。7.3抗菌药物工作溶液的制备7.3.1溶剂和稀释液用于制备抗菌药物储备液的溶剂和稀释液，除蒸馏水可高压灭菌外，其余应采用0.22μm微孔滤膜过滤除菌。7.3.2抗菌药物储备液的制备抗菌药物储备液的浓度应至少为最高测试浓度的10倍或者1000μg/mL以上，但对于某些溶解性低的抗菌药物可以制备较低浓度的储备液。7.3.3抗菌药物工作溶液的制备将抗菌药物储备液用M-H肉汤稀释至一定的工作浓度后，按倍比稀释法进一步稀释至一系列所需浓度(一般10个浓度梯度)，然后按顺序用多道移液器点入96孔板中，每块板横向10个稀释度，每孔0.1mL，设阴性和阳性对照。7.4菌液接种将调节至0.5麦氏单位的菌液用M-H肉汤稀释100倍，混匀备用。使用多道移液器吸取菌液0.1mL分别加入含系列抗菌药物溶液的药敏板中，或采用自动上样器进行接种，阴性对照孔除外，阳性对照为菌液0.1mL。阴性对照孔中加入0.1mL水解酪蛋白肉汤，盖好板盖。7.5培养将加有菌液和抗菌药物的板，置36±1℃培养箱中培养16～18小时。7.6结果判定取出培养后的药敏板，先观察阴性和阳性结果，阴性对照孔应无细菌生长，孔内液体未见浑浊；阳性对照孔应有细菌生长所形成的圆形或者网状沉淀。如果阴性和阳性对照结果正常，继续观察其余孔内细菌生长情况，无细菌生长的孔内所含最低抗菌药物浓度即为最低抑菌浓度（MIC）。或采用药敏结果判定仪进行判定。7.7质量控制在质控菌株的最低抑菌浓度符合规定范围的前提下，按判断标准判断被检菌株的敏感性－敏感（S）、中度敏感（I）或耐药（R）。对于只给出敏感判断标准的药物，只报告其是否敏感即可。可参DB21/T2743—20174考美国临床实验室标准化委员会CLSI的M07-A10、M37-A3和M45-A3的要求进行质量控制，按CLSI的M100-S26和M31-A3的临床折点判断标准进行耐药性判读和结果分析。7.8结果报告验结果的报告包括受试药物对实验菌株的MIC、质控菌株的MIC和实验菌株的名称、来源、孵育时间。DB21/T2743—20175AA附录A（规范性附录）培养基除非特殊注明，所用试剂均为分析纯；实验用水应符合GB/T6682中三级水的规格。A.1琼脂培养基A.1.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏3.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g~20.0g蒸馏水1000mLA.1.2制法将除琼脂外的各成分溶于蒸馏水中，加入15%氢氧化钠溶液约2mL校正pH至7.2~7.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。分装三角瓶，121℃高压灭菌20min。有特殊生长要求的细菌应添加辅助生长试剂。A.2Mueller-Hinton肉汤（M-H肉汤）培养基A.2.1成分牛肉粉2.0g可溶性淀粉1.5g酸水解酪蛋白17.5g蒸馏水1000mLA.2.2制法将各成分溶于蒸馏水中，加入15%氢氧化钠溶液约2mL校正pH至7.2~7.4。加热煮沸，分装三角瓶，121℃高压灭菌15min。有特殊生长要求的细菌应添加辅助生长试剂，应含有20mg/L~25mg/LCa2+和10mg/L~12.5mg/LMg2+。_________________________________