DB21T 2734.2-2017 病菌PCR 分型诊断方法 第2部分产气荚膜梭菌PCR 分型检测方

ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2734.2—2017病菌PCR分型诊断方法第2部分：产气荚膜梭菌PCR分型检测方法MethodofPCRtypingdiagnosisforbacterialPart2：MethodofPCRtypingdetectionforClostridiumperfringens2017-02-23发布2017-03-23实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2734.2—2017I目次前言................................................................................II1范围..............................................................................12规范性引用文件....................................................................13缩略语............................................................................14原理..............................................................................15仪器和器材........................................................................16试剂和引物........................................................................16.1试剂..........................................................................26.2引物..........................................................................27操作步骤..........................................................................27.1样品的采集、前处理、存放与运输................................................27.1.1采样注意事项..............................................................27.1.2采样工具..................................................................27.1.3肠内容物的采集与前处理....................................................27.1.4粪便的采集与前处理........................................................37.1.5产气荚膜梭菌纯培养物......................................................37.1.6存放与运送................................................................37.2PCR检测.......................................................................37.2.1DNA提取...................................................................37.2.2PCR.......................................................................37.2.2.2电泳PCR反应条件......................................................47.2.2.3电泳..................................................................48试验成立的条件....................................................................49结果判定..........................................................................4附录A（规范性附录）试剂配制........................................................5A.1电泳缓冲液（50倍）............................................................5A.1.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（Ph8.0）.........................5A.1.2TAE(三羟甲基氨基甲烷一乙酸)电泳缓冲液(50倍)...............................5A.21%琼脂糖凝胶..................................................................5DB21/T2734.2—2017II前言标准《病菌PCR分型诊断方法》按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。标准《病菌PCR分型诊断方法》分为两个部分：——第1部分：大肠杆菌PCR检测方法；——第2部分：产气荚膜梭菌PCR分型检测方法。本部分为病菌PCR分型诊断方法的第2部分。本分由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本标准主要起草人：赵凤菊、顾贵波、关淼、杨本勇、于长泳、李井春、马建山、魏园园、梁乔、张雷、郑付华、王欣、邓文超、王竹DB21/T2734.2—20171病菌PCR分型诊断方法第2部分：产气荚膜梭菌PCR分型检测方法1范围本标准规定了产气荚膜梭菌A、B、C、D、E五型PCR检测方法的技术要求。本标准适用于产气荚膜梭菌病的诊断、监测及流行病学调查，适用于动物粪便、肠内容物及纯培养物中产气荚膜梭菌α-毒素、β-毒素、ε-毒素和ι-毒素基因的PCR检测。本标准中的试验操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）以上的实验室进行。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。中华人民共和国农业部公告第302号兽医实验室生物安全技术管理规范GB/T4789.13食品卫生微生物学检验产气荚膜梭菌检验SN0177出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌检验方法GB16548-2006病害动物和病害动物产品生物安全处理规程GB19489实验室生物安全通用要求SN/T2025-2007动物检疫实验室生物安全操作规范SN/T2709-2010国境口岸产气荚膜梭菌毒素检测方法3缩略语下列缩略语适用于本标准。DNA：脱氧核糖核酸（Diethylpyrocarbonate）bp：碱基对（basepair）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleosidetriphosphate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液（Trisacetate-EDTAbuffer）4原理根据产气荚膜梭菌产生的四种主要毒素即α-毒素、β-毒素、ε-毒素和ι-毒素基因序列设计五对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。5仪器和器材DB21/T2734.2—20172本技术规范中需应用下列仪器和器材：高速台式冷冻离心机（最大离心力12000g以上）、冰箱、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉、分析天平、15mL离心管、1.5mL离心管和0.2mL离心管、微量移液器和吸头等。6试剂和引物6.1DNA抽提试剂：DNAzol®Reagent，外观为淡绿色，于4～8℃保存。6.2无水乙醇：-20℃预冷。6.375%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20℃预冷。6.4Taq酶：ExTaqDNA聚合酶（5U/μL）。6.5dNTP(2.5mmol/L)。6.6阳性对照：羊梭菌病多联干粉灭活疫苗、针对ι-毒素的阳性质粒。6.7阴性对照：灭菌双蒸水。6.8无菌生理盐水。6.9TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液。6.10溴化乙锭。6.11DL2000DNAMarker。6.12引物用于PCR反应的引物浓度为20μmol/L，其序列及扩增产物大小见表1。表1产气荚膜梭菌引物序列表基因引物序列扩增产物大小bpF5’-TTACTGCCGTTGATAGCG-3’α-毒素R5’-TCATTTCCTGGGTTGTCC-3’475F5’-TTTCCGGTTAGATACTCGAT-3’β-毒素R5’-ACAGTTTCTTTCACGCTCCA-3’513F5’-CTCATAATGTCCCTTCAC-3’ε-毒素R5’-CTCATCTCCCATAACTGCT-3’272F5’-AATGGCGATGAAAAGCCTACAC-3’ι-毒素AR5’-GCATAACCTGGAATGGCTGATA-3’692F5’-TAGAATCAAATACCGCTGGTGA-3’ι-毒素BR5’-CTGGATATGCTGCAACTAAAGG-3’111注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所用实验使用的试剂等级均为不含DNA或DNase的分析纯或生化试剂；所有试剂均用无菌的容器分装。7操作步骤7.1样品的采集、前处理、存放与运输7.1.1采样注意事项采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。7.1.2采样工具DB21/T2734.2—20173药匙、15mL离心管和1.5mL离心管经121±2℃高压灭菌20min；剪刀、镊子经160℃干热灭菌2h。7.1.3肠内容物的采集与前处理无菌采取病死或剖杀动物的小肠内容物，装入15mL灭菌离心管中，按1﹕10倍体积加入无菌生理盐水，充分搅拌，室温放置30min，12000rpm离心20min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用。7.1.4粪便的采集与前处理用药匙无菌采取发病动物的新鲜粪便，装入15mL灭菌离心管中，按1﹕10倍体积加入无菌生理盐水，充分搅拌，室温放置30min，12000rpm离心20min，取上清液转入1.5mL离心管中编号备用。7.1.5产气荚膜梭菌纯培养物依据GB/T4789.13和SN0177进行产气荚膜梭菌的分离培养。挑取产气荚膜梭菌菌落，用1mL无菌生理盐水制备成一定浓度的菌悬液。然后转入1.5mL灭菌离心管中编号备用。7.1.6存放与运送采集或处理的样品应避免反复冻融(冻融不超过3次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在4h之内运送到实验室检测；无冷藏条件的，于采样后2h内送达实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。7.2PCR检测7.2.1DNA提取7.2.1.1取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为待检样品数+阳性对照管数+阴性对照管数，对每个离心管进行编号。7