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ICS67.120.30B50DB21辽宁省地方标准DB21/T2619—2016传染性造血器官坏死病毒LAMP检测方法Loop-mediatedisothermalamplificationdetectionmethodforInfectioushaematopoieticnecrosisvirus2016-04-27发布2016-06-27实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2619—20161前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。本标准主要起草单位：辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人：肇慧君，胡强，张雪，刘钊，栾慎顺，李叶，胡传伟。DB21/T2619—20162传染性造血器官坏死病毒LAMP检测方法1范围本标准规定了传染性造血器官坏死病毒(Infectioushaematopoieticnecrosisvirus，IHNV）病原分离和环介导恒温扩增（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）检测方法。本标准适用于IHNV病原的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样SN/T2123-2008出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范3符号代号和缩略语下列缩略语适用于本文件。CPE：细胞病变(cytopathiceffect)CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethylammoniumbromide）DEPC：焦炭酸乙二酯（diethypyrocarbonate）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）HEPES：羟乙基呱嗪乙硫磺酸[4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonicacid]RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）LAMP：环介导恒温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification）Betaine：甜菜碱Bst酶：BstDNA聚合酶（大片段）[BstDNApolymerase(largefragment)]AMV逆转录酶：AMVreversetranscriptasedNTP：脱氧核糖苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）4试剂、仪器和耗材4.1试剂4.1.1引物选取特异性的IHNV的糖蛋白基因（G基因）的序列，设计出能专一性鉴别传染性造血器官坏死病毒的特异性引物组，该引物组由如下四条引物组成：外引物1（F3）：5′-ATCGCGCTACCAGCTTCA-3′DB21/T2619—20163外引物2（B3）：5′-TCATTGTAGAGGGCCAGGAT-3′内引物1（FIP）：5′-GGTGGTGTTGTTTCCGTGCAATTTTTAATGGGAACGACCCTTTGG-3′内引物2（BIP）：5′-GTCGCCCAGTACAAGATGAGCATTTTCTTGGATGGGGTACGGATTT-3′4.1.2BstDNApolymerase：8U/μL，-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。4.1.3AMV逆转录酶：15U/μL，-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。4.1.42×reactionmixture：含40mMTris-HCL、20mM氯化钾溶液、20mM硫酸铵溶液、16mM硫酸镁溶液、0.2%Tween-20、1.6Mbetaine（甜菜碱）、2.8mMdNTPs。4.1.5Rnaseinhibitor：40U/μL。4.1.6显色液：浓度为1000×SYBRGreenⅠ。4.1.7阳性对照：IHNV参考株。4.1.8EPC细胞系：用M199培养液25℃培养。4.1.9FHM细胞系：用M199培养液25℃培养。4.1.10乙醇：分析纯，使用前预冷到-20℃。4.1.11氯仿：分析纯。4.2仪器与耗材4.2.1倒置显微镜。4.2.2恒温培养箱。4.2.3普通冰箱和超低温冰箱。4.2.4组织研磨器（研磨器处理参见附录B）。4.2.5高速台式离心机：≥7000g。4.2.6水浴锅或加热模块：65℃+1℃和100℃+1℃。4.2.7移液器：量程0.5μL～10μL，量程10μL～100μL，量程100μL～1000μL。4.2.896孔细胞培养板。4.2.90.2mL和1.5mL塑料离心管。4.2.10吸头，配套移液器待用。4.2.11计时器。注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。5生物安全要求采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守SN/T2123-2008的有关规定。6操作步骤6.1样本的采集与处理6.1.1采样待检测鱼，体长小于4cm的鱼苗取整条鱼，体长4cm～6cm的鱼苗取脑和内脏（包括肾），体长大于6cm的鱼取脑、脾和肾。按GB/T18088的标准采样。6.1.2样品处理DB21/T2619—20164用组织研磨器制备组织匀浆，按1:10的最终稀释度用M199培养液稀释，稀释液中含有1000IU/mL青霉素和1000μg/mL链霉素，于15℃下孵育2h～4h或4℃下孵育6h～24h，7000g离心15min，收集上清液。6.1.3病毒分离细胞传代使用胰酶-EDTA混合消化液（见附录A中A.1）。对1:10的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释，然后将1:10、1:100、1:1000的3个稀释度的上清液以适当体积分别接种到生长约24hEPC或FHM细胞单层的96孔板中，每孔的细胞单层最多接种100μL稀释液。15℃～20℃吸附0.5h～1h后，加入M199细胞培养液，置于25℃培养。设2个阳性对照（接种IHNV参考株）和1个空白对照（未接种病毒的细胞）。阳性对照和待测样品都接种细胞后，7d内每天用倒置显微镜检查。如果接种了被检匀浆上清稀释液的细胞培养中出现细胞病变（CPE），应立即进行鉴定。如果除阳性对照细胞外，没有CPE出现，则在培养7d后还要用敏感细胞进行盲传。传代时，将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻融一次，以7000g、4℃离心15min，收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，培养7d。每天用倒置显微镜检查。如果阳性对照也未出现CPE，则应换用EPC或FHM细胞和待测样品重新进行病毒学检查。6.2IHNV的LAMP检测6.2.1样品处理将450μL细胞病变悬液冻融后，放入1.5mL的塑料离心管，再加入450μLCTAB溶液（见附录A中A.3）并混匀，25℃作用2h。6.2.2核酸提取在含有样品的塑料离心管中加入600μL抽提液1（见附录A中A.4），用力混合至少30s。12000g离心5min，小心取上层水相（约800μL）。再加入700μL抽提液2（见附录A中A.5），用力混合至少30s。12000g离心5min，小心取上层水相（约600μL）。再加入-20℃预冷的1.5倍体积的无水乙醇，倒置数次混匀后，-208h℃以上沉淀核酸。12000g离心30min。小心倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体。37℃干燥20min或抽真空干燥，最后加10μLDEPC水溶解后，作为LAMP反应模板。或者选择等效的商品化试剂盒进行核酸的提取。6.2.3LAMP反应体系IHNVLAMP反应体系见表1。表1IHNVLAMP反应体系（25μL）组分工作液浓度加样量/μL2×reactionmixture2×12.5外侧上游引物（F3）5μmol/L1外侧下游引物（B3）5μmol/L1内侧上游引物（FIP）40μmol/L2内侧下游引物（BIP）40μmol/L2Rnaseinhibitor40U/μL0.5BstDNApolymerase8U/μL1AMV逆转录酶15U/μL0.35DB21/T2619—20165RNA模板－1DEPC水－3.656.2.4LAMP反应过程按照表1所述配制反应体系：63℃恒温扩增45min，802min℃使酶失活，反应即结束。6.2.5空白对照、阴性对照、阳性对照设置每次反应应设置阴性对照、空白对照和阳性对照。空白对照以DEPC水代替RNA模板。阴性对照以不含IHNV样品的RNA代替RNA模板。7结果观察在上述反应管中加入2μL显示液，轻轻混匀并在黑色背景下观察。显色液优选为荧光染料SYBRGreenⅠ。8结果判定在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：阳性结果：待检样品反应管液体呈绿色，该样品检测结果为阳性。阴性结果：待检样品反应管液体呈橙色，该样品检测结果为阴性。DB21/T2619—20166AA附录A（规范性附录）试剂的配制A.1胰酶-EDTA混合消化液氯化钠（NaCL，分析纯）0.8g氯化钾（KCL，分析纯）0.02g磷酸二氢钾（KH2PO4，分析纯）0.02g磷酸氢二钾（K2HPO4，分析纯）0.115g乙二胺四乙酸（EDTA，分析纯）0.02g胰酶（分析纯）0.1g双蒸水100mL过滤除菌后分装备用。A.2培养液M199培养基，按说明书的要求配制，然后加入10%的胎牛血清，抽滤除菌，4℃保存。开放系统使用时，加入过滤除菌的HEPES，使其在培养液中的终浓度为0.02mol/L。A.3CTAB溶液按2%CTAB，1.4mol/LNaCL，20.0mmol/LEDTA，20.0mol/LTris-HCLpH7.5配制。用前家巯基乙醇到终浓度为0.25%。A.4抽提液1酚/氯仿/异戊醇，用1.0mol/LpH（7.9+0.2）Tris饱和过的重蒸酚：氯仿：异戊醇按25:24:1的比例混合，密闭避光保存。A.5抽提液2氯仿/异戊醇，将氯仿和异戊醇按24:1的比例混合，密闭避光保存。DB21/T2619—20167BB附录B（资料性附录）耗材去RNA酶的处理方法本方法适用于本标准中所使用的研磨器、离心管和吸头。使用前于180℃干燥8h以上，或用0.1%DEPC水浸泡处理。DEPC处理时，先在37℃浸泡2h，然后用灭菌水漂洗数次，于100℃干烤15min，去除器皿上残余的DEPC。_________________________________