DB21∕T 2592.2-2016 鸡传染性疾病检测方法 第2部分鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-P

ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB21/T2592.2—2016鸡传染性疾病检测方法第2部分：鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-PCR诊断技术DetectionmethodofchickeninfectiousdiseasePart2：DiagnostictechniqueoffluorescentRT-PCRforavianinfectiousbronchitisvirus2016-03-18发布2016-05-18实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2592.2-2016目次前言.................................................................................21范围..............................................................................32规范性引用文件....................................................................33缩略语............................................................................34仪器与器材........................................................................35试剂与材料........................................................................46操作步骤..........................................................................46.1样品的采集、保存和制备........................................................46.1.1采样工具..................................................................46.1.2样品的采集................................................................46.1.3样品的保存................................................................46.1.4样品的制备................................................................56.2核酸的提取....................................................................56.2.1编号......................................................................56.2.2裂解......................................................................56.2.3沉淀......................................................................56.2.4洗涤......................................................................56.2.5干燥......................................................................56.2.6溶解......................................................................56.3RT-PCR检测....................................................................56.3.1反转录反应体系............................................................56.3.2PCR反应体系...............................................................66.3.3检测条件设置..............................................................66.4结果判定......................................................................66.4.1结果分析条件设定..........................................................66.4.2质控标准..................................................................66.4.3结果描述及判定............................................................7附录A（资料性附录）磷酸盐缓冲生理盐水配方..........................................8附录B（规范性附录）生物安全注意事项................................................9DB21/T2592.2-2016前言标准《鸡传染性疾病检测方法》按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。标准《鸡传染性疾病检测方法》分为三个部分：——鸡传染性法氏囊病毒荧光RT-PCR检测方法；——鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-PCR诊断技术——鸡马立克氏病毒实时荧光PCR检测方法本部分为标准《鸡传染性疾病检测方法》的第2部分本部分由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。本部分由辽宁省畜牧兽医局归口。本部分起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。本部分主要起草人：吴运谱、赵晓彤、薛树山、魏园园、石霖、李红魁、王宏燕、闫海滨、李井春、孙世宇、孙洪志、梁伟DB21/T2592.2-2016鸡传染性疾病检测方法第2部分：鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-PCR诊断技术1范围本部分规定了鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-PCR诊断所用的引物、反应程序、判断标准等技术要求。本部分适用于禽类及其产品中鸡传染性支气管炎病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。中华人民共和国农业部公告第302号兽医实验室生物安全技术管理规范3缩略语下列缩略语适用于本标准。IBV：鸡传染性支气管炎病毒（avianinfectiousbronchitisvirus）DEPC：焦炭酸二乙酯（diethypyrocarbonate）PBS：磷酸盐缓冲生理盐水（phosphatebuffersaline）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应(reversetranscription-polymerasechainreaction)Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数（Cyclethreshold）4仪器与器材4.1荧光PCR扩增仪4.2高速台式冷冻离心机（最大离心力12000g以上）4.3冰箱（2℃～8℃，-20℃和-70℃三种）4.4分析天平4.5组织样品研磨器4.6医用剪刀4.7镊子4.8微量移液器（1000μL、100μL和10μL三种）4.9吸头（1000μL、100μL和10μL三种）4.101.5mL离心管4.1115mL离心管DB21/T2592.2-20164.120.5mLPCR反应管4.13医用棉签5试剂与材料5.1Trizol：RNA抽提试剂，外观为粉红色，分装至棕色瓶中，于4℃～8℃保存。5.2氯仿：4℃预冷。5.3异丙醇：4℃预冷。5.475%乙醇：用无水乙醇和DEPC水配制，-20℃预冷。5.5DEPC水：去离子水中加入0.1%DEPC，37℃作用1h，121℃±2℃，高压灭菌15min。5.6RNA酶抑制剂（40U/μL）。5.7DNA聚合酶：HSTaqDNA聚合酶（5U/μL）。5.8dNTP(2.5mmol/L)。5.9反转录酶：AMV反转录酶（5U/μL）。5.10阴性对照：DEPC水。5.11阳性对照：疫苗株H120株5.12PBS：磷酸盐缓冲生理盐水（0.02mol/LpH7.2）。5.13引物：用于RT-PCR反应引物浓度为10μmol/L，引物见下表1。表1鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-PCR检测用引物引物名称引物序列上游引物(5′-3′)5′-CACAGAAGTATTTGACCCCTTTGA-3′下游引物(5′-3′)5′-CCGTTCTTAGGAAACTCGTTGACA-3′6操作步骤6.1样品的采集、保存和制备6.1.1采样工具离心管（1.5mL、15mL）经121℃±2℃高压灭菌15min；医用剪刀、镊子、组织样品研磨器经160℃干烤2h。6.1.2样品的采集对病死鸡或其他病死禽类的采样，可解剖后采集气管及其分泌物或肺脏；对活禽的采样，可将棉拭子（医用棉签）深入喉头上腭及上腭裂来回刮3次～5次，使其蘸有咽喉分泌液，然后将咽喉拭子放入盛有1.0mLPBS的离心管中，编号备用。6.1.3样品的保存DB21/T2592.2-2016样品应置于特定样品保存液中进行保存。可采用PBS液（pH7.0～7.4,0.01mol/L）、0.85%生理盐水或不含有血清的细胞培养液作为保存液（含青霉素2000IU/mL、链霉素2000IU/mL、制霉菌素1000IU/mL，BSA5mg/mL）。样品采集后应置于加冰的保温箱中、密封，24h内送至实验室进行处理或置于-70℃保存。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。6.1.4样品的制备对气管或肺脏样品处理方法是:用医用剪刀将组织病料在研磨器中剪碎，按质量体积比（1:1）加入样品保存液进行研磨；对棉拭子的处理方法是:将棉拭子置于装有1mL样品保存液的离心管中，用镊子充分挤压后弃去拭子。以上样品室温静置作用30min，4℃3000r/min离心5min，取上清进行核酸提取。若样品为鸡胚增殖病毒的尿囊液，可直接采用尿囊液进行核酸提取。6.2核酸的提取6.2.1编号取n个灭菌的1.5mL离心管（n为被检样品数与阳性对照管数与阴性对照管数之和），并逐一编号。6.2.2裂解每管加入750μLTrizol，分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各250μL，颠倒10次混匀，室温静置5min；再加入250μL氯仿，混匀器上振荡混匀15s（也可以用手反复颠倒混匀）。4℃12000g离心15min。6.2.3沉淀取与6.2.1中相同数量灭菌的1.5mL离心管，加入500μL异丙醇(4℃预冷)。取6.2.2中离心后的上清液约500μL转移至相应的管中，颠倒混匀，室温静置15min。6.2.4洗涤4℃12000g离心15min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入1mL75%乙醇，颠倒洗涤。6.2.5干燥4℃12000g离心10min，弃上清，倒置于吸水纸上，