DB43∕T 1202-2016 饲料中氟苯尼考的测定 高效液相色谱法

湖南省地方标准DB43饲料中氟苯尼考的测定高效液相色谱法DeterminationofFlorfenicolinfeedsHighperformanceliquidchromatographicmethodDB43/T1202—2016湖南省质量技术监督局发布2017-02-13实施2016-12-13发布ICS65.120B46DB43/T1202—2016I目次前言………………………………………………………………………………………………………Ⅱ1范围……………………………………………………………………………………………………12规范性引用文件………………………………………………………………………………………13原理……………………………………………………………………………………………………14试剂与材料……………………………………………………………………………………………15仪器与设备……………………………………………………………………………………………16采样与试样的制备……………………………………………………………………………………27测定步骤………………………………………………………………………………………………28结果计算………………………………………………………………………………………………29灵敏度、准确度和精密度………………………………………………………………………3附录A（资料性附录）氟苯尼考高效液相色谱图……………………………………………………4DB43/T1202—2016II前言本标准按GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本标准某些内容可能涉及专利，本标准发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由湖南省畜牧水产局提出并归口。本标准起草单位：湖南省兽药饲料监察所、湖南省冷水江市农业局。本标准主要起草人：匡光伟、欧阳龙、隆雪明、邓昉、陈爱忠、张俊波、周玉洁、李裕、易建希、江燕、邓均红。DB43/T1202—20161饲料中氟苯尼考的测定高效液相色谱法1范围本标准规定了饲料中氟苯尼考（Florfenicol）的高效液相色谱测定方法。本标准适用于我省配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料中氟苯尼考的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备3原理采用30%甲醇溶液提取试样中的氟苯尼考，固相萃取柱净化，乙腈溶液洗脱，高效液相色谱-紫外法测定，外标法定量。4试剂与材料除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682一级水的规定。4.1甲醇，色谱纯。4.2乙腈，色谱纯。4.330%甲醇溶液：将30mL甲醇与70mL水混合均匀。4.440%乙腈溶液：将40mL乙腈与60mL水混合均匀。4.5氟苯尼考标准品，纯度≥99.7%。4.6标准储备液：称取氟苯尼考标准品25mg（精确到0.01mg）于25mL的容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，即为1.00mg/mL的氟苯尼考标准储备液。-18℃以下避光保存，可保存1年。4.7标准工作液：移取适量氟苯尼考标准储备液，用40%乙腈溶液稀释成浓度为(1.00~100)µg/mL的氟苯尼考标准工作液，现配现用。4.8微孔滤膜：0.22μm，有机膜。4.9OasisHLB固相萃取柱：60mg，3mL，或相当者。5仪器与设备5.1高效液相色谱仪：配有紫外或二极管阵列检测器。5.2分析天平：感量0.00001g和0.001g。DB43/T1202—201625.3离心机：转速≥10000r/min，带有50mL离心管。5.4超声波清洗机。6采样与试样的制备6.1采样按GB/T14699.1的规定执行。6.2试样制备按GB/T20195的规定执行。7测定步骤7.1提取称取试样2g（精确到0.001g），置于50mL离心管中，准确加入20mL30%甲醇溶液，涡旋振摇1min，超声提取5min，涡旋30s后静置分层，于50mL离心管中10000r/min离心5min，取上清液供固相萃取柱净化。7.2净化将固相萃取柱依次用3mL甲醇、3mL水活化，准确移取6.0mL上清液过柱，用3mL水、3mL30%甲醇溶液淋洗固相萃取柱，真空抽干。3mL40%乙腈溶液洗脱，收集全部洗脱液。涡旋混匀，0.22μm微孔滤膜过滤后，供高效液相色谱分析。7.3测定7.3.1高效液相色谱参数色谱柱：C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，或相当者。流动相：乙腈+水（V+V=22+78）。流速：1.0mL/min。进样量：20μL。检测波长：225nm。7.3.2试样测定取试样溶液和相应的标准工作液进样，以组分的保留时间定性，以色谱峰面积积分值做单点或多点校准，外标法定量。标准工作液和试样溶液中氟苯尼考的响应值均应在仪器检测的线性范围内。氟苯尼考高效液相色谱图参见附录A，氟苯尼考标准工作液色谱图参见附录A中图A1，饲料中添加氟苯尼考标准物质色谱图参见附录A中图A2。7.3.3空白试验除不加试料外，采用上述相同步骤操作。8结果计算试样中氟苯尼考的含量由色谱数据处理软件或按下式计算获得：DB43/T1202—20163SSCAVXAm××=××fX——试样中氟苯尼考的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；A——试样中氟苯尼考的峰面积；Cs——标准工作液中氟苯尼考的浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；As——标准工作液中氟苯尼考的峰面积；V——最终定容体积，单位为毫升（mL）；m——试样质量，单位为克（g）；f——样品的稀释倍数。计算结果需扣除空白试样值，测定结果用两次平行测定的算术平均值表示。测定结果保留三位有效数字。9灵敏度、准确度和精密度9.1灵敏度氟苯尼考在饲料中的定量限为10mg/kg。9.2准确度本方法氟苯尼考在10mg/kg、20mg/kg、100mg/kg添加浓度水平上的回收率范围为（70~110）%。9.3精密度本方法的批内变异系数≤10%，批间变异系数≤15%。DB43/T1202—20164附录A(资料性附录）氟苯尼考高效液相色谱图图A1氟苯尼考标准工作液色谱图（2µg/mL）图A2饲料中添加氟苯尼考标准物质的色谱图(10mg/kg)