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ICS65.150B50备案号：51404-2016DB32江苏省地方标准DB32/T2957-2016鲤疱疹病毒Ⅱ型PCR检测方法PCRinspectionspecificationofcyprinidherpesvirusⅡ2016-09-20发布2016-11-20实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T2957-2016I前言本标准按GB/T1.1–2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写规则》要求进行编写。本标准由江苏省海洋与渔业局提出。本标准起草单位：江苏省水生动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：陈辉、袁锐、方苹、倪金俤、刘训猛、陈静、郭立新、吴亚锋DB32/T2957-20161鲤疱疹病毒Ⅱ型PCR检测方法1范围本标准规定了鲤疱疹病毒Ⅱ型（cyprinidherpesvirusⅡ）检测方法的试剂和材料、仪器和设备、采样、检测步骤和结果判断。本标准适用于鲫鱼疱疹病毒病病原的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法SC/T7014-2008水生动物产地检疫采样技术规范3试剂和材料3.1水符合GB/T6682-2008中一级水的规格。(该水用来配置规范性附录A中所列试剂)3.2无水乙醇3.3十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）3.4TaqDNA聚合酶及配套的10×PCR缓冲液TaqDNA聚合酶或ExTaqDNA聚合酶，生化试剂，-20℃保存。10×PCR缓冲液为该酶配套的相应反应缓冲液，生化试剂，-20℃保存。3.5MgCl2（25mmol/L）：生化试剂，-20℃保存。3.6dNTPs混合物含dATP、dTTP、dCTP、dGTP各10mmol/L的混合物，-20℃保存。3.75×TBE电泳缓冲液（按附录A的规定）。3.86×DNA上样缓冲液（按附录A的规定）。3.9引物及扩增片段鲤疱疹病毒Ⅱ型DNA聚合酶基因扩增引物：P1：5’-CCCAGCAACATGTGCGACGG-3’，P2：5’-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3’。扩增片段大小为362bp。注：该引物为扩增鲤疱疹病毒Ⅱ型DNA聚合酶基因的通用引物。3.10DNA分子量标准DB32/T2957-20162宜使用DNAmarker2000，各片段大小依次为：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp，也可使用其他合适的DNA分子量标准。3.11阳性对照阳性对照为已知受鲤疱疹病毒Ⅱ型感染，且PCR检测结果为鲤疱疹病毒Ⅱ型阳性并经测序验证的DNA模板，-20℃保存。3.12阴性对照好阴性对照为已知未受鲤疱疹病毒Ⅱ型感染，且PCR检测结果为鲤疱疹病毒Ⅱ型阴性的组织，提取DNA，-20℃保存。3.13空白对照灭菌双蒸水（无DNA酶）。3.14核酸染色剂GoldviewTM核酸染料或其他宜使用的核酸染料。4仪器和设备4.1台式高速离心机：最高转速可达12000rpm以上。4.2普通冰箱：具有冷藏箱，-20℃以下冷冻箱体。4.3PCR仪。4.4电泳仪：输出直流电压0-600V。4.5水平电泳槽。4.6凝胶成像仪。4.7水浴锅或者金属浴。5采样5.1采样数量按SC/T7014-2008中6.1的规定执行。5.2个体要求活鱼或濒死的鱼。5.3采样部位有临床症状的鱼，如体长不超过4cm，取鳃；体长为4cm~6cm，取鳃和内脏（包括肾）；体长大于6cm，则取脑、肝、肾、脾和鳃组织。无症状的鱼取肾、脾、鳃和脑组织。性成熟雌鱼还需取卵巢液。DB32/T2957-201635.4操作要求5.4.1采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。5.4.2镊子，剪刀等取样工具需要进行灭菌（湿热灭菌为121℃，20min；干燥灭菌为160℃，3小时）。5.4.3实验室以外的环境下采得的组织样品需用液氮及时保存。6检测步骤6.1DNA抽提6.1.1取100mg左右待检新鲜组织与300μLCTAB溶液研磨匀浆，置于1.5mL离心管内。加入450uLCTAB溶液并混匀，65℃放置2h。6.1.2加入600μL酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）至样品离心管中，持续上下颠倒用力混合至少1min，12000r/min4℃离心10min，小心取上层水相（约700μL）置于新的1.5mL离心管中。6.1.3加入700μL氯仿-异戊醇（24:1），用力混合至少30s，12000r/min4℃离心5min，小心取上层水相（约600μL）置于新的1.5mL离心管中。6.1.4加入-20℃预冷的1.5倍体积无水乙醇（约900μL），倒转数次混匀后，置-20℃沉淀1h以上。6.1.512000r/min4℃离心30min，小心去上清，倒置于吸水纸上吸干水分；室温干燥或真空干燥。6.1.6加10μL双蒸水溶解，作为DNA模板。DNA抽提也可选用商品化病毒DNA抽提试剂盒，按相应说明书提供的方法予以抽提。6.2基因扩增6.2.1按表加入除了TaqDNA聚合酶和待检DNA模板或对照以外的各项试剂，配成无酶反应预混物。PCR反应体系表试剂50μL体系100μL体系试剂终浓度10×PCR缓冲液（无Mg2+）5101×MgCl2（25mmol/L）5102.5mmol/LdNTP(10mmol/L)120.2mmol/L100pmol/μL引物F10.511pmol/μL100pmol/μL引物R10.511pmol/μL灭菌双蒸水32.7565.5TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.250.50.025U/μL待检DNA模板或对照5106.2.2将无酶反应预混物按44.75μL（50μL体系）或89.5μL(100μL体系)预混液分装，保存于-20℃（最多保存六个月）。在临用前，根据所需的反应份数，取出无酶反应预混物，加入相应体积的TaqDNADB32/T2957-20164聚合酶，混匀，即成完全反应预混物。6.2.3将完全反应预混物按1份/支分装到无DNA聚合酶的0.2mLPCR待检管、阳性对照管、阴性对照管、空白对照管中，分别在待检管、阳性对照管、阴性对照管、空白对照管中加入相应体积的样品待检DNA模板、阳性对照DNA、阴性对照DNA、空白对照（50μL体系加5μL，100μL体系加10μL）。6.2.4将上述PCR管置于PCR扩增仪中。94℃预变性5min；95℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min，40次循环；72℃延伸10min；4℃保温。6.3琼脂糖凝胶电泳6.3.1用电泳缓冲液TBE配制1.5%的琼脂糖（加入相应量的核酸染料，加入量参见该核酸染料说明书）凝胶，厚0.5cm左右。6.3.2将平板放入水平电泳槽，电泳缓冲液刚好淹没胶面。6.3.3加样：10μL样品加入2μL样品缓冲液，混匀后加入样品孔。6.3.4电泳：5V/cm电泳约30min停止。6.3.5紫外灯下观察核酸带，并记录结果。7结果判断7.1PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，当阳性对照出现一条362bp的DNA条带，阴性对照和空白对照没有扩增条带，待检样品出现一条与阳性对照一致的DNA条带（同样为362bp）则判定为鲤疱疹病毒Ⅱ型阳性。7.2当PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测出现可疑条带时，应将待检样品的琼脂糖凝胶电泳检测条带回收后进一步进行DNA测序。将所测序列与已知的鲤疱疹病毒Ⅱ型DNA聚合酶基因序列（参考附录B）比较，同源性达95%以上判定为鲤疱疹病毒Ⅱ型阳性。DB32/T2957-20165AA附录A（规范性附录）试剂及其配制A.1CTAB溶液按2%CTAB、1.4mol/LNaCl、20.0mmol/L，EDTA、20.0mol/LTris-HClpH7.5配制。用前加巯基乙醇至终浓度为0.25%（配制时在60ml水中顺序加入：8.19gNaCl，0.744gEDTA，1.21gTris，约0.25-0.3mL浓HCl,使pH=7.5-8.0，再加入2gCTAB，完全溶解后加水至100mL）。A.2酚—三氯甲烷—异戊醇用1.0mol/LpH7.9±0.2Tris过饱和的重蒸酚、三氯甲烷和异戊醇按25:24:1的比例混合，密闭避光保存。A.3三氯甲烷—异戊醇将三氯甲烷和异戊醇按24:1的比例混合，密闭避光保存。A.4TBE电泳缓冲液（5×浓缩液）Tris54.0g硼酸27.5g乙二胺四乙酸2.922g加水到1000.0mL用5.0mol/L的盐酸调至pH8.0。A.56×DNA上样缓冲液溴酚蓝100mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜。待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至50mL。加入氢氧化钠（NaOH）溶液1滴，调至蓝色。DB32/T2957-20166BB附录B（资料性附录）鲤科疱疹病毒Ⅱ型DNA聚合酶基因参考序列（GenBank登录号：AY939863.1）1CCCAGCAACATGTGCGACGGAGGCATCAGCCCAGAGTCCATAGTGTCTAGGAGCGACCCG61TTCTGTCTCGAGTATGTCAGAAACTGCGTGCTGCTCGATTGGAAAAAGATACCGGCCGCC121AGTAACATGGAAGAGATCAAGGAATACCCGCACAGCGAAGACCTGTACACGATCCTGTGC181TACAAGAACCGAGAGGTCGGTTGGACTCGGTTTGTGACCTACACCGCTTCCAGTCTGGGC241CACTACCTCTCTATGAGATCTCAGTACAAGAAACGCATCAAGACCGAGAAAGACGCGAGT301CTCAAGGCGTACTATGATCAGATGCAGGGTGAGATGAAAGTATGCGCCAACTCTCACTAC361GGCGTGAGCCAGAGTCTCTGTCAGCATCTGACTACTTGGTCCGGACGCCAAAAGATTCTG421CTGGTCGAGAACGCTGTAAAACACACTCCGGGTATGACCGTCGTGTA注：下划线表示相应的上、下游引物结合序列DB32/T2957-20167CC附录C（资料性附录）鲤疱疹病毒Ⅱ，型特异性PCR电泳图从左至右依次为：1：DNAMark；2：阳性对照；3：阴性对照；4：空白对照；5：阳性结果。_________________________________2000bp750bp1000bp250bp500bp100bp12345