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ICS65.020.20B05DB13河北省地方标准DB13/T2404—2016猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法2016-09-30发布2016-12-01实施河北省质量技术监督局发布DB13/T2404—2016I前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由河北省畜牧局提出。本标准起草单位：河北农业大学。本标准主要起草人：袁万哲、孙继国、宋勤叶、马增军、金东航、李丽敏、张磊、李睿文。DB13/T2404—20161猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法1范围本标准规定了猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的技术要求。本标准适用于检测猪粪便、腹泻猪胃肠及其内容物和这些采集样品培养物中的猪流行性腹泻病毒。2缩略语下列缩略语适用于本文件。DEPC：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate）；dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）；EB：溴化乙锭（ethidiumbromide）；PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）；RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）；RT-PCR：反转录-聚合酶链式反应（reverse-transcriptionpolymerasechainreaction）；Vero细胞：非洲绿猴肾细胞；cDNA：互补脱氧核糖核酸。3主要仪器3.1PCR仪。3.2凝胶成像系统。3.3台式低温高速离心机。3.4电泳仪。3.5电泳槽。3.6冰箱。3.7微量移液器。3.8水浴锅。4主要试剂4.1LSTRIzolRNA提取试剂或其他商品化的RNA提取试剂。4.2氯仿。4.31.0%琼脂糖凝胶：见附录A中A.1。4.450×TAE缓冲液：见附录A中A.2。DB13/T2404—201624.510ug/μLEB或核酸染料：见附录A中A.3。4.6DEPC处理的灭菌的双蒸水：见附录A中A.4。4.7DNA分子量标准（100bp）。4.8反转录酶。4.9RNA酶抑制剂。4.102×TaqMasterMix（Dye）。4.11dNTP。4.12商品化的一步法RT-PCR反应试剂：含有RT-PCR缓冲液，酶混合物，dNTP混合物，无RNA酶的水等。5引物上游引物与下游引物见附录B。引物浓度为10μmol/L。6样品对照以灭活的猪流行性腹泻病毒Vero细胞培养物或者感染猪粪便、肠粘膜作为阳性对照，以正常Vero细胞培养物或者是正常猪粪便、肠粘膜作为阴性对照。7操作步骤7.1样品的采集与处理。7.1.1采集工具采集工具应经121℃±2℃，20min高压灭菌并烘干。采集工具如下：a)棉拭子；b)剪刀；c)镊子；d)1.5mL离心管；e)研钵。7.1.2粪便采集将棉拭子深入肛门转一圈沾取粪便；将采集后的棉拭子放入盛有1.0mLPBS（见附录A中A.5）的1.5mL的离心管，加盖，编号。7.1.3胃或肠及内容物的采集用绳子将胃或肠两端扎紧，用剪刀采集胃肠等，装入一次性灭菌容器，编号。7.1.4样品储运DB13/T2404—20163样品采集后放入密闭的塑料带内（一个采集点的样品放一个塑料带内），于保温箱中加冰，密封24h内送至实验室。7.1.5样品的处理7.1.5.1棉拭子处理方法样品在混合器上充分混合后，用高压灭菌的镊子将拭子中的液体挤出，弃去拭子，4℃条件下3000r/min离心15min，取上清液转入无菌的1.5mL离心管中，编号备用。7.1.5.2胃或肠及内容物的处理方法将所采集的胃或肠及内容物至于洁净，灭菌并烘干的搪瓷盘中，抽取内容物或者取刮取胃肠粘膜按照质量体积比（1:1）加入样品保存液进行充分研磨，4℃条件下3000r/min离心15min。取上清转入无菌的1.5mL的离心管备用，编号。7.2RNA的提取7.2.1用LSTRIzol试剂提取待检样品、阳性对照及阴性对照样品的RNA。7.2.2将250μL经过预处理的待测样品加入750μLTRIzolLSReagent中，振荡2min，室温放置5min。7.2.3加入250μL氯仿，在微量振荡器上振荡1min，室温放置5min后，4℃条件下12000r/min离心15min。7.2.4吸取上层水相转入一新的离心管中，加入等量的异丙醇，混匀，室温放置15min，4℃条件下12000r/min离心15min。7.2.5小心吸弃上清液，加入DEPC处理的75%乙醇700μL～800μL，4℃条件下12000r/min离心5min。7.2.6小心吸弃上清液，将沉淀自然风干或于50℃干燥箱中晾干，加适量的DEPC水溶解。7.2.7提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增，若需长期保存，须至于-80℃的冰箱保存。7.2.8也可采用商品化的RNA提取试剂，按照说明书进行操作。同时进行阴阳对照样品RNA的提取。7.3RT-PCR7.3.1反转录反应（cDNA的合成）取上述步骤所得的病毒总RNA11μL，加入2μL浓度为10µmol/L的反转录引物，加入4μL5×反转录缓冲液、0.5μL反转录酶、0.5μLRNA酶抑制剂、2μLdNTPMixture，最终至总体积为20μL，42℃水浴1h，即得到cDNA溶液，直接用于下面的PCR扩增或-20℃冻存备用。7.3.2PCR反应在反应管中依次加入8μL无核酸酶水、10μL2×TaqMasterMix(Dye)、1μLcDNA溶液、0.5μL浓度为10µmol/L的上游引物、0.5μL浓度为10µmol/L的下游引物，最终至总体积为20μL，经充分混匀后瞬时离心使液体全部聚集于管底。DB13/T2404—20164PCR扩增反应条件：94℃预变性3min，94℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸25s，循环30次；72℃延伸5min。扩增反应结束后立即进行电泳或放置4℃备用。8扩增产物的电泳检测制备1.0%琼脂糖凝胶板。在电泳槽内加入1×TAE电泳缓冲液，使液面超过凝胶。取3μL～5μL扩增产物加到凝胶孔，加入分子量标准。恒压（110V）电泳30min～40min，将点用好的凝胶放到凝胶成像系统上观察结果。9实验成立的描述阳性对照的扩增产物经电泳检测，在预期大小的条带位置均出现特异性的条带；阴性的扩增产物没有预期的目的条带；阴阳性同时成立表明实验有效，否则实验无效。10结果判定在试验结果成立的前提下，如果样品的RT-PCR产物电泳后在477bp位置出现特异性的条带（RT-PCR产物电泳图见附录C中C.1），则判定为猪流行性腹泻病毒核酸检测阳性；如果样品的RT-PCR产物电泳后在477bp位置未出现特异性的条带，则判定为猪流行性腹泻病毒核酸检测阴性。DB13/T2404—20165附录A（规范性附录）相关试剂的配制A.11.0%琼脂糖凝胶称取琼脂糖1.0g，放入100mL1×TAE电泳缓冲液中，加热融化，温度降至60℃时，加入5μL核酸染料，均匀铺板，厚度为3mm～5mm。A.250×TAE电泳缓冲液A.2.10.5mol/LEDTA溶液（pH8.0）称取EDTA18.61g，加灭菌双蒸水至100mL，后用氢氧化钠调pH至8.0。A.2.2TAE电泳缓冲液（50×）Tris242g，冰乙酸57.1mL，0.5mol/LEDTA100mL，加灭菌双蒸水至1000mL。A.3溴化乙锭（EB）溶液溴化乙锭20mg，加灭菌双蒸水至20mL。A.4DEPC水焦碳酸二乙酯（DEPC）50μL，加灭菌双蒸水至100mL，室温放置6h-8h，121℃±2℃高压灭菌20min，分装到1.5mLDEPC处理过的离心管。A.5PBS缓冲液A.5.1A液（0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液）：NaH2PO4·H2O27.6g先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至1000mL。A.5.2B液（0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液）：Na2HPO4·7H2O53.6g，（或Na2HPO4·127H2O71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g）先用适量蒸馏水溶解，最后用蒸馏水稀释至1000mL。A.5.30.01mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液的配制：.A液14mL，B液36mL，加氯化钠（NaCl）8.5g，最后用蒸馏水稀释至1000mL。DB13/T2404—20166附录B（规范性附录）引物引物的名称、浓度及序列见表B.1。表B.1引物名称引物浓度（μmol/L）序列（5'-3'）上游引物10ACGGGTGCCATTATCCCTCTAT下游引物10GACTGGTTGTTGCCTCTGTTGTDB13/T2404—20167附录C（规范性附录）猪流行性腹泻病毒RT-PCR产物电泳图猪流行性腹泻病毒RT-PCR产物电泳图见图C.1。M-DNA分子量标准（100bp）；1-阳性对照；2-阴性对照。图C.1猪流行性腹泻病毒RT-PCR产物电泳图_________________________________