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ICS13.020.01Z17DB21辽宁省地方标准DB21/T2687—2016外来海洋微藻监测技术规程Technicalspecificationforalienmarinemicroalgaeminitoring2016-09-27发布2016-11-27实施辽宁省质量技术监督局发布DB21/T2687—2016I前言本标准按照GB/T1.1-2009标准化工作导则起草。本标准由辽宁省海洋水产科学研究院提出。本标准由辽宁省海洋与渔业厅归口。本标准主要起草单位：辽宁省海洋水产科学研究院（辽宁省海洋环境监测总站）。本标准主要起草人：宋伦、王年斌、宋广军、宋永刚、吴景、杨爽、吴金浩、赵海勃、张津源。本标准首次发布。本标准附录A为资料性附录，附录B为规范性附录。DB21/T2687—20161外来海洋微藻监测技术规程1范围本标准规定了外来海洋微藻监测的术语和定义、监测内容、监测方法及技术要求、结果分析、监测报告等。本标准适用于辽宁省管辖海域所进行的外来海洋微藻监测工作。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T12763.6海洋调查规范第6部分：海洋生物调查HY/T069海洋赤潮监测技术规程DB21/T2427海洋褐潮监测技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本规程。3.1外来海洋微藻alienmarinemicroalgae出现在其过去或现在的自然分布范围及扩散潜力以外的微微型、微型、小型浮游植物。3.2外来入侵海洋微藻invasivealienmarinemicroalgae在本海域的自然或半自然生态系统或生境中建立了种群，可能对本海域浮游植物群落结构或生态环境造成明显影响的外来海洋微藻。3.3微微型浮游植物pico-phytoplankton细胞粒径大小介于0.2μm-3.0μm的浮游植物。3.4微型浮游植物nano-phytoplankton细胞粒径大小介于3.0μm-20.0μm的浮游植物。3.5小型浮游植物micro-phytoplanktonDB21/T2687—20162细胞粒径大小介于20.0μm-200.0μm的浮游植物。3.6生态危害ecologicalhazard外来海洋微藻对生态系统的生物因子、非生物因子所产生的不利影响。3.7常规监测routingmonitoring对外来入侵海洋微藻的海域浮游植物种类和数量进行连续调查以掌握浮游植物群落的变化。跟踪监测trackingmonitoring对已形成优势物种的外来入侵海洋微藻进行全过程的跟踪、取样、分析工作，若暴发赤潮、褐潮后应增加监测频次。4监测内容实时监测目标海域外来海洋微藻的种类、数量及扩散范围。5监测方法及技术要求5.1站位布设5.1.1布设原则——站位应布设在外来海洋微藻入侵概率较大的海域；——尽可能与海洋环境质量监测站位位置相一致；——应考虑监测海域的水动力状况和功能，选择上升流区、港口和增养殖区布设站位；——站位的布设应覆盖或代表监测海域。5.1.2布站方法5.1.2.1常规监测根据实际情况，采用T型（河口近岸海域）、井字型、梅花型、网格型，布设控制断面和监测站位。监测站位应覆盖整个监测区，沿潮流方向站位间距应小于一个潮程，潮流垂向站位间距应小于1km。监测区面积小于50km2，测站不能少于6个；监测区面积等于或大于50km2，测站不能少于12个；当发现外来海洋微藻时，应增加监测站位数量。5.1.2.2跟踪监测根据外来海洋微藻发现范围和漂移状态，分别在发生区内、外水域分别设立目标种监测站位和对照站位，站位数量应随外来海洋微藻的扩散范围而增加。5.2监测区域根据外来海洋微藻入侵途径，重点监测沿海各大港口、码头、锚地邻近海域及周边养殖区。5.3监测时段、频率、面积DB21/T2687—201635.3.1监测时段、频率常规监测：4月-9月每月监测1次；若发现外来海洋微藻，则每周监测1次。跟踪监测：发现外来海洋微藻超过预警值起（即微微型浮游植物密度超过107个/升，微型、小型浮游植物超过HY/T069中表5、表6的基准密度），每周2次或酌情增加次数。5.3.2监测面积监测外来海洋微藻出现最外围监测站位包含的水域范围。出现由外来海洋微藻引发的水色异常后采用卫星遥感、航空遥感或船舶GPS定位方法界定海水异常范围及坐标，记录发生面积、位置及时间要素。5.4监测分析方法5.4.1监测备航外来海洋微藻监测备航应准备-20℃冰柜或液氮罐、采水器、抽滤装置、500ml广口瓶、5000ml采样桶、微孔滤膜（孔径为0.22μm）以及固定剂，固定剂配制和使用按GB/T12763.6执行。5.4.2现场观测、调查现场观测海区水色、味、嗅、漂浮物，向渔民调查监测海区是否有水体变色、异味、异常飘浮物或海产品死亡以及贝类滞长等异常现象。5.4.3样品采集与预处理采集2L-5L表层海水2份，一份首先经100目（孔径为150μm）的筛绢过滤，然后用0.22μm孔径的硝酸纤维素膜收集微微型、微型及小型浮游生物，将滤膜转移至5mL无菌离心管中，置于-20℃（短期）或-80℃（长期）冰箱冷冻保存，用于总浮游植物DNA提取；另一份用鲁哥氏液固定，用于实验室小型浮游植物镜检。5.4.4基因组DNA的提取5.4.4.1裂解藻细胞上述过滤滤膜移入1.5mL灭菌离心管中，用灭菌剪刀将其剪碎，加入500μL十六烷基三甲基溴化铵（CTAB法）缓冲液、1μL巯基乙醇、5μL蛋白酶K混和均匀，放入55℃空气浴中1h-2h，直到藻液呈透明状。5.4.4.2抽提加入300μL饱和酚，300μLCI(氯仿∶异戊醇=24：1)轻柔颠倒5min，使之呈乳浊液；4℃离心（14000×g）10min，小心用微量吸头取出上清液(约500μL)至无菌离心管中，加入500μLCI混匀，4℃离心（14000×g）10min。5.4.4.3沉淀小心用微量吸头取出上清液(约400μL)至无菌离心管中，加二倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的乙酸/乙酸钠（NaAc）缓冲液，充分混匀，放入-20℃冰箱30min；4℃离心（14000×g）10min，小心弃上清。5.4.4.4洗涤DB21/T2687—20164DNA沉淀用预冷的70%酒精洗两次，每次洗涤后都需离心，小心弃上清。5.4.4.5溶解将沉淀真空干燥或自然晾干，溶于20μL-40μLTE缓冲液中，置于-20℃待用。5.4.5PCR扩增5.4.5.1PCR引物、反应体系以制备得到的藻类DNA作为模板，以V4-R/F作为引物，进行聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，简称PCR）。V4-R/F引物：V4F：5'-GCGGTAATTCCAGCTCCAATA-3'；V4R：5'-GATCCCCHWACTTTCGTTCTTGA-3'PCR反应体系为50μL，其中包括5U/μLTaqDNA聚合酶0.2μL、10×PCR缓冲液(10mmoL/LTris-HCl，500mmol/LKCl，2.0mmol/LMgCl2和0.01%明胶，pH8.3)4.5μL，脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）(200mmol/L)4.5μL，上下游引物10μmol/L各1μL、20ng的模板DNA2μL，以无菌水补充体系至50μL。5.4.5.2反应程序94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，33个循环；72℃延伸5min。5.4.5.3扩增产物检测采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，凝胶电泳时间为20min-30min。5.4.6文库构建和DNA片段测序使用建库试剂盒进行文库构建，构建好的文库经过Qubit仪器定量和文库检测，合格后，使用Hiseq2500PE250模式进行上机测序。5.4.7OTU聚类和物种注释测序得到的原始数据经拆分、拼接、过滤，利用Uparse软件对所有样品的全部有效标记进行聚类，默认以97%的一致性将序列聚类成为分类操作单元（OperationalTaxonomicUnits，OTUs），同时选取OTUs的代表性序列进行物种注释，用RDP分类方法与席尔瓦（Silva）数据库进行物种注释分析（设定阈值为0.8~1.0），并分别在各个分类水平：界、门、纲、目、科、属、种统计各样本的群落组成。5.4.8数量统计按GB/T12763.6采水调查方法镜检同期水样中小型浮游植物种类和数量，根据OTUs比例，分别测算微微型、微型浮游植物数量。截至目前辽宁海域发现的外来海洋微藻参见附录A。6结果分析分析来源地与评估海域的环境相似性，对入侵海域水温、盐度等耐受能力，分析入侵微藻的繁殖、生态策略，评估其建立自然种群的可能性。分析入侵微藻的生态习性，最适生长的生态阈值、最大环境容量，评估其扩散可能性。DB21/T2687—20165分析入侵微藻是否含有毒素，有无化感物质，可否形成休眠孢子，对其他经济生物影响大小，评估其生态危害。7监测报告小型、微型、微微型浮游植物细胞数量填报应满足附录B的要求。监测结果应于监测结束后或送交鉴定的标本鉴定结果返回后7日内汇总上报。监测区域发现外来海洋微藻后，应于3日内将初步结果上报，包括监测人、监测时间、监测海域或范围、初步发现入侵微藻的生境和发生面积等信息，并在详细情况调查完成后7日内上报完整的监测报告。监测中所有原始数据、记录表、标本、影像资料等均应进行整理后妥善保存，以备复核。_________________________________DB21/T2687—20166附录A（资料性附录）辽宁沿海主要的外来海洋微藻入侵及时间序号种类拉丁名中文名引入方式来源地引入时间1金藻PhaeocystisglobosaScherffel球形棕囊藻压舱水不详19972金藻Aureococcusanophagefferens抑食金球藻压舱水美国20093硅藻Rhizosoleniastyliformis笔尖根管藻压舱水不详20034硅藻Bacteriastrumcomosum丛毛辐杆藻压舱水不详20035硅藻Coscinodiscuswailesii威氏圆筛藻压舱水不详不详6硅藻Pseudo-nitzschiadelicatissima柔弱伪菱形藻压舱水北美洲19967甲藻Gymnodiniumcatenatum链状裸甲藻压舱水、养殖设施无意引入日、韩不详8甲藻Guinardiaflaccida短裸甲藻压舱水不详不详9甲藻Peridiniumperardiforme多甲藻压舱水北美洲199610甲藻Prorocentrumminimum微小原甲藻压舱水不详不详11甲藻Prorocentrummicans海洋原甲藻压舱水不详不详12甲藻Alexandriumtamarense塔玛亚历山大藻压舱水不详199213甲藻Alexandriumcatonella链状亚历山大藻压舱水不详不详14甲藻Amphidiniumcarterae强壮前沟藻压舱水不详不详15甲藻Dinophysisfortii倒卵形鳍藻压舱水日本199816甲藻Dinophysisacuminata渐尖鳍藻压舱水日本199517甲藻Dinophysisacuta尖锐鳍藻压舱水不详不详18甲藻Dinophysiscaudata具尾鳍藻压舱水日本199719甲藻Dinophysisrotundata圆形鳍藻压舱水日本200920甲藻Akashiwosanguinea红色赤潮藻压舱水日韩199821黄藻Heterosigmaakashiwo赤潮异弯藻压舱水日本1985DB21/T2687—20167附录B（规范性附录）浮游植物细胞数量记录表表B.1小型浮游植物细胞数量计数记录表第页共页标本编号站号水深（m）采水量（mL）浓缩体积（mL）记数体积（mL）调查时间记数时间序号种名数量（个）小计统计（个/L）备注12345678910111213141516171819202122232425硅藻种数（种